HPLC測定羅布麻茶黃酮主要組成成分及其體外抗氧化特性研究

張 靜 任小利 - 李希希 - 易 沙 李 沖 趙 欣 n

(1. 重慶化工職業學院環境與質量檢測學院，重慶 401228；2. 重慶第二師范學院重慶市功能性食品協同創新中心，重慶 400067)

羅布麻屬野生草本多年半灌木，多分布于中國西北地區[1]。羅布麻葉除被作為中藥使用外，也被加工成茶類飲品使用。羅布麻葉含有黃酮類、有機酸類、苯丙素類及多種氨基酸和礦物質，能起到降血壓、降膽固醇、抗衰老、提高免疫力[2-5]及抗抑郁[6-7]等功效。植物黃酮是一類具有較強抗氧化能力的物質，能有效清除自由基[4-5]。黃酮類為羅布麻葉中最主要的功效成分[8]，羅布麻葉所含黃酮類成分主要有蘆丁、槲皮素、異槲皮苷、金絲桃苷、木樨草素等[8-10]。羅布麻部分生理活性作用已得到初步驗證，主要是基于羅布麻的粗提物，而羅布麻活性成分與其作用間的關系尚未清楚，尤其是對羅布麻黃酮成分的分析及產生抗氧化活性作用的機制尚未見報道。

羅布麻茶黃酮成分的提取方法主要有超聲提取法[11]、加熱回流法[12]、聚酰胺層析法[13]、大孔樹脂法[14]。蘆丁和異槲皮苷均為多羥基黃酮類化合物，結構中存在大量的羥基，極性強，易溶于極性溶劑。試驗擬采用減壓加熱回流結合大孔吸附法提取新疆羅布麻茶中的黃酮類物質，通過高效液相色譜分析法測定羅布麻茶黃酮中蘆丁和異槲皮苷含量，對羅布麻茶黃酮的體外抗氧化效果進行檢測，并結合黃酮成分的分析結果對羅布麻茶黃酮的作用機制進行闡述，為羅布麻茶進一步功能性開發研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅布麻茶：野生羅布麻茶，新疆沙雅縣；

蘆丁、異槲皮苷對照品：分析純，北京索萊寶科技有限公司；

1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)：分析純，梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；

2'-聯氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)：分析純，南京都萊生物技術有限公司；

VC(抗壞血酸)：分析純，北京索萊寶科技有限公司；

甲醇、乙腈：色譜純，重慶川東化工有限公司；

乙酸、硫酸亞鐵、過硫酸鉀、30%過氧化氫、水楊酸、無水乙醇：分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜系統：Ultimate 3000型，美國Thermo Scientific公司；

多功能酶標儀：Varioskan LUX型，美國Thermo Scientific公司；

超聲波清洗器：KQ-250ES型，昆山市超聲儀器有限公司；

電子分析天平：XB4200C型，瑞士Precisa公司；

超純水制造系統：UPH-Ⅱ-20T型，四川優普超純科技有限公司；

旋轉蒸發儀：RE-2000B，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 羅布麻茶黃酮提取 FL-3大孔樹脂先用無水乙醇浸泡24 h，再用3%鹽酸浸泡2 h后用蒸餾水沖洗至中性，用蒸餾水浸泡待用。將50 g干羅布麻茶粉碎過40目篩后在茶粉中加入70%乙醇(料液質量比20∶1)，然后于60 ℃水浴中浸提3 h。提取液通過大孔樹脂后黃酮物質被吸附，再用乙醇(50%，60%，70%，80%，質量分數)洗脫樹脂上的黃酮物質，洗脫至樹脂無色即黃酮物質完全被洗出，然后用旋轉蒸發儀旋蒸黃酮洗出液，最后得到蒸干的黃酮提取物。

1.3.2 標品溶液配制 精密稱取適量蘆丁、異槲皮苷標品，加入甲醇溶解，分別配制成濃度為1.812 5，1.033 3 mg/mL 的蘆丁、異槲皮苷標品溶液。分別精密吸取0.2 mL蘆丁、異槲皮苷標品液，再用甲醇配制成濃度分別為0.181 25，0.103 33 mg/mL 的混標溶液。

1.3.3 樣品溶液 精密稱取0.5 g羅布麻多酚提取物粉末于10 mL容量瓶中，用甲醇進行定容，超聲處理后用0.45 μm 濾膜過濾，待測。

1.3.4 色譜條件 色譜柱AgilentzorbaxSB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，按表1進行梯度洗脫，流動相A為乙腈，流動相B為0.5%乙酸溶液，流速0.6 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長359 nm，進樣量10 μL[15]。

表1 HPLC流動相梯度洗脫程序

1.3.5 線性關系 將蘆丁、異槲皮苷標品溶液稀釋后分別進樣1，2，4，8，12，16，20 μL，按1.3.4色譜條件進行分析。以標品進樣質量為橫坐標X，以相應峰面積為縱坐標Y，得兩種標品的線性方程。

1.3.6 精密度、重現性和穩定性試驗

(1) 精密度試驗：取上述混標溶液重復進樣5次，每次10 μL，按上述1.3.4色譜條件對峰面積進行測定。

(2) 重現性試驗：精密稱取1.3.1方法制備好的樣品5份，按1.3.3方法制備待測樣品溶液，在1.3.4色譜條件下進行測定。

(3) 穩定性試驗：取同一樣品溶液，分別在0，2，4，6，8，10，12，24 h按1.3.4色譜條件對蘆丁、異槲皮苷的峰面積進行測定。

1.3.7 回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品3份，按1.3.3方法制備樣品溶液，分別配制成1.3.2中蘆丁、異槲皮苷標準品濃度的80%，100%，120%，在已知的色譜條件下進行測定，每份樣品測定3次，計算回收率、平均回收率及RSD值。

1.3.8 樣品含量測定 稱取同一樣品粉末3份(每份接近0.1 g，平均0.097 3 g)，按1.3.3方法制備3份樣品溶液，用1.3.4色譜條件對樣品中蘆丁、異槲皮苷的峰面積進行測定，并計算樣品中二者的含量及平均含量。

1.3.9 抗氧化能力測定 準確稱取1.3.1得到的樣品粉末和VC，配置成1.0 mg/mL的樣品和VC溶液，依次加水稀釋成不同濃度的樣品和VC(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.8 mg/mL)溶液，備用。

(1) DPPH自由基清除試驗：參照Aneta等[16-17]的方法，略有改進。取3個離心管(標記為A1，A2，A3)分別加入不同濃度的樣品和試劑。其中A1離心管中加入DPPH溶液2.9 mL、樣液100 μL；A2離心管中加入無水乙醇2.9 mL、樣液100 μL；A3離心管中加入DPPH溶液2.9 mL、80%甲醇溶液100 μL。均勻混合后，于暗處反應30 min，517 nm下測定吸光度，計算DPPH清除率。以VC為陽性對照。

(2) ABTS自由基清除試驗：參照Ye等[18-19]的方法，略有改進。取3個離心管(標記為A1，A0，A空)分別加入不同濃度的樣品和試劑。其中A1離心管加入ABTS溶液2.0 mL、樣液80 μL；A0離心管加入超純水2.0 mL、樣液80 μL；A空離心管加入ABTS溶液2.0 mL、無水乙醇80 μL。均勻混合后，于暗處反應6 min，734 nm下測定吸光度，計算ABTS自由基清除率。以VC為陽性對照。

(3) 羥基自由基清除試驗：參照賈榮等[20]方法，略有改進。取3個離心管(標記為A0，Ai，Aj)分別加入不同濃度的樣品和試劑。其中A0離心管加入80%甲醇300 μL、FeSO4溶液1.0 mL、水楊酸乙醇溶液1.0 mL 和H2O21.0 mL；Ai離心管加入樣液300 μL、FeSO4溶液1.0 mL、水楊酸乙醇溶液1.0 mL 和H2O21.0 mL；Aj離心管加入樣液300 μL、FeSO4溶液1.0 mL、水楊酸乙醇溶液1.0 mL 和80%甲醇溶液1.0 mL 。均勻混合后，于37 ℃ 水浴鍋中反應30 min，510 nm下測定吸光度，計算羥基自由基清除率。以VC為陽性對照。

1.4 數據處理

對試驗進行3次平行測定，計算觀察指標的平均值。采用Excel軟件對試驗數據進行處理及分析。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 流動相的選擇 試驗比較了甲醇—水、乙腈—水流動相對出峰時間和分離效果等的影響。通過比較基線分離和峰形對稱的要求發現，選擇乙腈—水作為流動相進行梯度洗脫效果最佳，且蘆丁、異槲皮苷分離效果較好。由于加入酸可減少拖峰現象[18]，因此在水相中加入了0.5%磷酸，最終確定的流動相為乙腈—0.5%磷酸水溶液。

2.1.2 檢測波長的選擇 在254，280，328，359 nm進樣檢測后發現，蘆丁、異槲皮苷在359 nm時響應最好，色譜峰面積較大且分離效果好。故選擇359 nm為最佳檢測波長，此波長處蘆丁、異槲皮苷均有較強吸收峰(圖1)。

1. 蘆丁 2. 異槲皮苷

2.1.3 線性關系分析 進一步的試驗顯示蘆丁、異槲皮苷的線性方程分別為Y=26.026X+10.496(R2=0.999 55)，Y=45.57X+4.580 7(R2=0.999 65)，且分別在0.453 1～9.062 5，0.258 3 ～5.166 5 μg的范圍內呈現良好的線性關系。

2.1.4 精密度、重現性、穩定性試驗 在精密度驗證中蘆丁和異槲皮苷的峰面積RSD值分別為0.11%和0.10%(n=5)，表明本方法的精密度良好。在重現性驗證中蘆丁和異槲皮苷含量的RSD值分別為1.57%和1.09%(n=5)，表明本方法重現性良好。在穩定性驗證中蘆丁和異槲皮苷的RSD值分別為1.16%和0.42%，表明蘆丁和異槲皮苷在樣品溶液中至少24 h內保持穩定。

2.1.5 回收率 由表2可知，蘆丁、異槲皮苷的平均回收率分別為99.91%，100.05%(n=9)，表明高效液相法用于羅布麻茶黃酮的質量控制具有良好的準確性。

2.1.6 樣品含量測定 由表3可知，羅布麻茶黃酮中含有一定量的蘆丁和異槲皮苷，占黃酮總量的50%以上，且異槲皮苷含量高且穩定，與文獻[15]報道結果基本一致。

2.2 樣品提取方法的優化

由表4可知，當乙醇濃度<70%時，隨著乙醇濃度的增加，蘆丁、異槲皮苷提取量均明顯增加；但當乙醇濃度>70%時，蘆丁、異槲皮苷提取量均減小。故確定以70%乙醇為提取溶劑。

表2 回收率試驗結果

表3 羅布麻茶黃酮中蘆丁、異槲皮苷含量

表4乙醇濃度對羅布麻茶黃酮中蘆丁、異槲皮苷提取量的影響

Table 4 Effect of ethanol concentration on the extraction of rutin and isoquercetin inApocynumvenetumtea

乙醇濃度/%蘆丁含量/mg異槲皮苷含量/mg500.050 3±0.000 50.638 8±0.040 8600.054 9±0.000 50.658 1±0.041 2700.059 6±0.000 60.673 9±0.039 7800.056 8±0.000 40.663 7±0.039 1

2.3 羅布麻茶體外抗氧化評價

2.3.1 清除DPPH自由基的能力 由圖2可知，在一定濃度范圍內羅布麻茶黃酮樣品和VC樣品對DPPH均有一定的清除作用。隨著羅布麻茶黃酮樣品濃度的增加，對DPPH自由基清除作用不斷增強，當其濃度為0.3 mg/mL時清除能力最大，清除率達73.1%，此后隨著濃度增加清除率趨于平穩。羅布麻茶黃酮清除能力明顯高于同濃度的VC對DPPH的清除能力，說明羅布麻茶純化后的黃酮樣品有較強的清除DPPH自由基的能力。

圖2 羅布麻茶黃酮的DPPH清除率

2.3.2 清除ABTS自由基的能力 由圖3可知，羅布麻茶黃酮對ABTS自由基有一定的清除能力，隨著樣品濃度的增加，清除能力逐漸增強。在樣品濃度為1 mg/mL時清除率高達60.2%，此時VC對ABTS的清除率僅為20.8%，故羅布麻茶清除ABTS自由基的能力較強。

圖3 羅布麻茶黃酮的ABTS清除率

2.3.3 清除羥基自由基的能力 由圖4可知，當羅布麻茶黃酮樣品和VC濃度在0.2～0.4 mg/mL時，清除能力相當，清除率在6%～10%；隨著樣品濃度的增加，羅布麻茶黃酮對羥基自由基清除率明顯增強，當濃度為1.0 mg/mL 時，清除率達25.7%，清除能力遠大于同濃度VC，可能與黃酮類化合物分子結構中所含羥基數有關。

3 結論

試驗利用高效液相色譜法測定了羅布麻茶黃酮中蘆丁、異槲皮苷含量，并通過體外試驗發現羅布麻茶黃酮對DPPH自由基、ABTS自由基和羥基自由基均具有良好的清除作用。本研究中提取的羅布麻茶黃酮中蘆丁、異槲皮苷含量占黃酮總量的50%以上，通過包括蘆丁、異槲皮苷在內的黃酮起到了較好的體外清除自由基能力。但本研究中只針對含量最高的蘆丁和異槲皮苷含量進行了具體分析，研究[21-22]顯示，不同的羅布麻黃酮還含有金絲桃苷、槲皮苷、白麻苷、山萘酚-3-O-β-D-蕓香糖苷、扁蓄苷和乙酰化金絲桃苷等物質，因此羅布麻茶黃酮成分分析及各物質間的協同作用有待進一步研究。

圖4 羅布麻茶黃酮的羥基自由基清除率