成品卷煙霉變微生物的分離純化與鑒定

雷 聲 楊乾栩 - 師艷萍 - 蔣舉興 - 劉秀明 -張 玲 陳文怡 - 汪雪嬌 - 曾熠程 -

(1. 云南中煙工業有限責任公司技術中心，云南 昆明 650231；2. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

中國是世界第一煙葉生產國，產量約占世界總產量的1/3[1]。伴隨著中國卷煙消費結構的持續提升，消費者對優質卷煙產品的安全性和質量的要求也日益提高。由于調制后的煙葉中含有豐富的糖、有機酸、生物堿等營養物質，為霉菌的生長繁殖提供了條件。卷煙在流通及貯藏過程中，受環境溫度、濕度的影響，發生霉變現象有一定幾率，導致卷煙質量瑕疵甚至報廢，造成巨大經濟損失[2]。

向東紅[2]從川渝不同地區的煙片中篩出了21種霉菌菌株，檢出率較高的主要為黃曲霉(Aspergillusflavus)和橘青霉(Penicilliumcitrinum)等；晏衛紅等[3]從廣西的多處倉庫煙葉中分離鑒定出9種曲霉，包括黑曲霉(Aspergillusniger)和聚多曲霉(Aspergillussydowii)等；曾婷英等[4]對烘烤期的霉變煙葉進行鑒定，發現導致霉變的主要為米根霉(Rhizopusoryzae)。大多數研究都是對卷煙生產前倉儲期的霉變煙葉或煙片進行篩選和鑒定，而成品卷煙在后續的流通及貯藏過程中霉變微生物的分離和鑒定研究較少，成品卷煙流通及貯藏期間所處環境(包括溫度、濕度等)與煙葉、煙片等在倉儲期間所處環境不同，對卷煙微生物的影響不同[5]。研究[6-8]表明，卷煙霉變微生物主要有曲霉屬、青霉屬和枝孢霉屬菌株。

試驗擬采用3種不同的培養基涂布分離、劃線培養純化，再通過形態學和顯微鏡檢個體形態、18S rDNA-ITS序列測定，分離、純化和鑒定云南霉變卷煙中的微生物，并基于一種模擬卷煙環境的培養基，對篩分所得霉變微生物的致霉程度進行評價。旨在針對性地為銷售期及后續貯藏期的防霉措施及防霉包裝技術等提供科學依據，以減少卷煙經濟損失，提高卷煙產品質量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

霉變卷煙：以肉眼可見霉變為標準，篩選出流通環節的霉變成品卷煙，分3批采樣，每批不少于100支，云南中煙工業有限責任公司技術中心；

煙葉：云南中煙工業有限責任公司技術中心；

氯霉素、瓊脂、乳酸、氯化鈉、苯酚、酒石酸鉀鈉、無水乙醇、甲基藍：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基、氯硝胺18%甘油瓊脂(DG18)培養基、孟加拉紅培養基：青島海博生物技術有限公司；

煙汁培養基：5%煙葉浸出液1 000 g，氯霉素0.1 g，瓊脂18.0 g，115 ℃滅菌20 min。

1.1.2 儀器與設備

電子天平：EL3002型，梅特勒—托利多有限公司；

生物安全柜：BSC-1500IIA2-X型，濟南鑫貝西生物技術有限公司；

恒溫恒濕培養箱：HWS-150型，上海森信實驗儀器有限公司；

手提式壓力蒸汽滅菌器：YXQ-LS-18SI型，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；

金相顯微鏡：BX51型，日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 卷煙霉變微生物的分離純化 參照GB 4789.15—2016的方法，稍作修改。稱取霉變成品卷煙10 g，加入0.85% 無菌生理鹽水90 mL，(28±1) ℃、180 r/min搖床震蕩培養2～3 d，得到原始菌懸液，依次稀釋10倍梯度。吸取1 mL菌懸液涂布于孟加拉紅、PDA和DG18培養基中，恒溫培養箱(28±1) ℃、85% RH培養5 d。挑取少量菌落菌絲，劃線于相應培養基中，(28±1) ℃、85% RH條件下培養2 d，純化3代，得到形態單一的菌落，于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 卷煙霉變微生物的菌落特征分析 挑取1.2.1純化后的少量菌絲，點植于PDA培養基平板的中間位置，(28±1) ℃、85% RH條件下培養5 d。觀察菌落的形態特征，根據《真菌鑒定手冊》[9]初步鑒定。

1.2.3 卷煙霉變微生物的個體形態特征分析 采用透明膠帶鏡檢法[10]。在載玻片上滴乳酸石炭酸棉蘭染液，用食指與拇指使透明膠帶呈U形，膠面朝下，輕輕觸及1.2.1 的單一菌落表面，浸入載玻片上的乳酸石炭酸棉蘭染色液中，顯微鏡下觀察，并根據GB 4789.16—2016進行鑒定。

1.2.4 18S rDNA-ITS序列分析 參照Li等[11]方法，并稍作修改。取1.2.1得到的單一菌落平板進行18S rDNA-ITS序列測定。18S rDNA-ITS區域PCR反應使用引物ITS1和ITS4擴增ITS片段，30 μL反應體系含17.8 μL ddH2O，3 μL Buffer，2 μL dNTP，3 μL Primer1，3 μL Primer2，1 μL模板DNA，0.2 μL Tag酶。PCR反應過程：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，循環35次，72 ℃延伸10 min，12 ℃保存。瓊脂糖凝膠電泳條件：3 μL樣品+1%瓊脂糖凝膠，Marker條帶100，250，500，750，1 000，2 000，3 000，5 000 bp。北京六合華大基因科技有限公司武漢分公司進行樣品的序列測定，所得序列拼接校準對齊后，于NCBI數據庫進行BLAST同源性比對，構建系統進化樹，同源性>99%為種分界閾值，將待測菌株鑒定到種[12]。

1.2.5 卷煙霉變微生物致霉性測定 取50.0 g煙葉，加入1 000 mL蒸餾水煮沸，2層紗布過濾兩次后，加入18.0 g 瓊脂，定容至1 000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻至50 ℃左右，每200 mL培養基中加入20 mg氯霉素，搖晃均勻并冷卻備用，得到煙汁培養基平板。挑取1.2.1 純化后的少量菌絲，點植于煙汁培養基中心，倒置于(28±1) ℃、85% RH培養條件的恒溫恒濕培養箱中培養5 d，以十字交叉法測量菌落直徑，每組3個平行。以未點植處理的煙汁培養基平板作為陰性對照組。

1.3 數據處理

試驗重復3次，通過Excel進行數據處理，以“平均值±標準偏差”表示。

2 結果與討論

2.1 卷煙霉變微生物形態學分析

經多次劃線分離、點植培養得到約20株形態不同的霉變菌株，對其培養形狀(如隆起度、邊緣、表面形狀、光澤、顏色等)進行觀察；通過顯微鏡檢，觀察霉變微生物的分生孢子、分生孢子梗、頂囊、有無橫隔等個體形態情況，初步鑒定篩選得到形態各異的5個種，分別編號為A、B、C、D、E。霉變微生物菌落形態、個體形態特征及其描述如圖1、2和表1所示。

由圖1可知，5種菌的菌落均呈圓形，C菌落近似橢圓形，A、C菌落表面光滑，B、D、E表面均呈絨毛狀；B、C、E菌落中心呈高凸起，其余為低凸起或無凸起；PDA培養基培養5 d后，B菌落直徑最大，除中間菌落外，培養基邊緣有孢子散落形成的較小菌落，生長較為茂盛。

由圖2可見，5種菌株的菌絲均有隔膜，A、B、E菌株檢出有分生孢子梗，分別為掃帚狀、倒燒瓶狀和卵狀；C、D未檢出分生孢子梗，且菌絲有大量分支。

2.2 卷煙霉變微生物的菌株鑒定

由圖3可知，500 bp條帶濃度為60 ng/3 μL，顯示為加亮帶，其余條帶濃度均為30 ng/3 μL。

圖1 霉變微生物菌落形態特征

圖2 霉變微生物個體形態特征

表1 霉變微生物菌落形態和個體形態描述

電泳方向從上向下

將提取得到的DNA于高通量測序平臺上機檢測，得到18S rDNA-ITS序列，根據NCBI數據庫進行BLAST比對，與NCBI數據庫中的序列進行同源性分析，找出與待測菌株序列相似度最高且已知分類地位的真菌菌株，根據待測菌株的形態學結果、鏡檢觀察結果和ITS序列分析鑒定待測菌株的種屬。5株卷煙霉變微生物鑒定結果為4個屬，分別為曲霉屬、青霉屬、枝孢屬和鏈格孢屬，相似度均在99%以上，所得5株卷煙霉變微生物鑒定結果如表2所示，分別為聚多曲霉、黃曲霉、極細枝孢霉、指狀青霉及鏈格孢屬菌(種名未知)，形態學及顯微鏡檢結果與18S rDNA-ITS序列測定結果相一致。

在卷煙霉變微生物分離和鑒定方面，李躍鋒等[6]篩選出卷煙致霉菌為球孢枝孢霉、黃曲霉、桔青霉和米曲霉；王儒等[7]篩選得到枝孢屬、桔青霉和黃曲霉等曲霉屬菌株；謝欣等[8]篩選得到枝孢霉屬、黃曲霉菌和桔青霉菌。試驗篩選得到多個菌屬，與文獻[6-8]結果一致，曲霉屬、青霉屬和枝孢屬菌株常見于霉變卷煙，而試驗篩選所得鏈格孢屬菌株未見報道，為首次發現。綜上可知，黃曲霉多次篩分自霉變卷煙，表明其在霉變卷煙中分布較為廣泛和突出；除黃曲霉外，試驗篩選所得其他致霉菌種均與文獻[6-8]結果不同，可能與卷煙產地包裝環境和流通環節儲存環境等因素有關。

表2 卷煙霉變微生物的18S rDNA-ITS序列分析

將5株卷煙霉變微生物測試所得18S rDNA-ITS序列構建系統進化樹。采用鄰位相連法(Neighbor-Joining，NJ)進行進化距離分析[13]，運用Bootstrap對系統進化樹進行檢驗，重復1 000次[14]。由圖4可知，5株卷煙霉變微生物的ITS序列聚為4個分支，劃分為曲霉屬、青霉屬、枝孢屬、鏈格孢屬，相同屬的進化關系較近，以較高的支持率聚在同一分支。

圖4 卷煙霉變微生物的18S rDNA-ITS系統進化樹

Figure 4 Phylogenetic tree of the strains isolated frommoldycigarettes based on the 18S rDNA-ITS sequence

2.3 卷煙霉變微生物致霉性測試

由表3可知，在5種卷煙霉變微生物中，B黃曲霉致霉性最強，菌落直徑達(56.92±1.09) mm，為卷煙霉變微生物主要菌株，致霉能力突出，與李春艷等[15]從河南倉儲煙葉中分離、純化得到的優勢霉變菌株相同；致霉性最弱的為極細枝孢霉，僅為(12.47±0.76) mm。

表3 卷煙霉變微生物致霉性測試

3 結論

研究采用PDA、DG18和孟加拉紅培養基，從霉變卷煙中分離純化出20株霉變微生物，再通過形態學和顯微鏡檢，初步鑒定為5種形態各異的霉變微生物，分別為2種曲霉屬菌，1種青霉屬菌，1種鏈格孢屬菌和1種枝孢屬菌。通過18S rDNA-ITS序列分析及構建系統進化樹，鑒定為5個種，分別為聚多曲霉、黃曲霉、極細枝孢霉、指狀青霉和一株鏈格孢屬霉菌，與文獻[6-8]篩分所得菌屬基本一致，菌種有所不同，其中鏈格孢屬霉菌未見相關報道。通過致霉性試驗進一步明確黃曲霉菌[(56.92±1.09) mm]為卷煙霉變的主要菌株，同時也是卷煙霉變報道中多次出現的常見菌株和煙葉霉變優勢菌株，具有導致煙葉及煙草制品霉變的廣泛性和突出性。霉變卷煙的微生物分布、致霉特征和優勢菌株鑒定可為卷煙霉變防治、防霉劑研發等提供依據。