氯化鈣對酸雨脅迫下烤煙葉片表觀特征和葉綠素熒光特性的影響

徐宗藝，陳泉印，米 良，黃雨萌，王 月，孫廣玉

東北林業大學生命科學學院，哈爾濱市香坊區和興路26 號 150040

天然降水通常受溶解的二氧化碳影響，其pH一般為5.6 左右［1］。而隨著城鎮的工業化發展，對化石燃料能源的需求量日益增加，同時燃燒過程中向大氣排放氮和硫的氧化物也越來越多，直接導致大氣酸沉降增加［2-3］。目前，酸沉降已成為世界三大環境問題之一［3-5］。近年來，隨著中國經濟的發展，受酸雨濕沉降影響的土地面積逐年擴大，危害越來越嚴重［6］。長期及過量的大氣酸沉降對生態系統及人體健康具有較大的危害性，而在整個生態系統中，植物是酸沉降污染的主要受體［7］。酸沉降會腐蝕植物體表皮、造成植物體內的酶和葉綠素部分失活、膜質過氧化、自由基平衡遭受破壞，植物抵抗環境脅迫的能力降低［4，8-14］。鈣不僅是植物必需的礦質營養元素，而且可作為細胞內生理生化反應的第二信使偶聯胞外信號。因此，可以通過穩定細胞壁和細胞膜結構并誘導特定基因的表達來提高植物體的抗逆性［15-18］。通過施加外源鈣提高植物抗性的方法已在小麥、玉米、苜蓿、龍眼和番茄等作物，以及水果和蔬菜上得到應用［19-23］。烤煙是我國重要的葉用經濟作物，而已有的烤煙在逆境脅迫下的研究主要集中在細胞膜透性、氣候斑的形成以及抗病性等方面［24-25］，對烤煙光合機構的研究報道較少，尤其在烤煙受酸雨脅迫后施加外源鈣的研究方面尚鮮見報道。為此，以烤煙品種龍江911 為材料，通過檢測煙草葉片表觀傷害、吸收光能能力、電子傳遞速率及PSⅡ供體側、受體側和反應中心活性，以及檢測光合碳同化能力等，研究酸雨濕沉降對植物葉片光合機構造成的傷害，明確在酸雨脅迫條件下施加外源氯化鈣的緩解作用，旨在為酸雨頻發地區的烤煙栽培管理提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試烤煙品種為龍江911，由黑龍江省煙草科學研究所提供。試驗在東北林業大學植物生理實驗室酸雨棚中進行。采用傳統營養缽育苗，待烤煙幼苗長至4葉1心時，移栽至直徑15 cm、高20 cm的培養缽中，每缽定植1 株，以草炭土∶蛭石=2∶1（體積比）的混合物作為培養基質。在溫度25 ℃/23 ℃（光/暗）、光照強度400 μmol·m-2·s-1、光周期12 h/12 h（光/暗）、相對濕度75%的人工氣候箱中培養，每周澆灌1 次稀釋1 倍的Hoagland 營養液。待幼苗長到6 葉1 心時選取長勢一致的煙苗進行酸雨處理。

1.2 試驗處理

設置模擬酸雨溶液處理組pH 2.5、pH 3.5、pH 4.5 和pH 5.5 共4 個。依據黑龍江省的酸雨類型并參照有關研究報道［26］，按［SO42-］和［NO3-］比例為1∶3，配制酸雨母液。同時配制電解質母液（pH 7.0），主要離子成分及濃度為31.46 mg/L NaF、26.28 mg/L KCl、74.91 mg/L CaCl2、171.28 mg/L MgSO4和82.27 mg/L NH4Cl。通過稀釋1 000 倍電解質母液將酸雨母液酸度調整至pH 2.5、pH 3.5、pH 4.5 和pH 5.5 的模擬酸雨，以清水為對照（CK）。將制備的測試溶液儲存在棕色玻璃試劑瓶中并標記。模擬酸雨采用噴霧法噴灑，用500 mL 園藝噴霧器每天噴1 次，每次對烤煙葉片正反面均勻噴灑至葉尖流下細密的液滴為止，連續噴7 d，在每天7：00—8：00 進行噴灑處理，為避免相互干擾，在不同處理間用塑料薄膜將植株分離，噴灑酸雨后第2 天澆水。

在pH 2.5 處理組煙株葉片出現癥狀后噴施10 mmol·L-1CaCl2溶液（pH 7.0）。均勻噴施在葉片的正面和背面，噴在葉片上的CaCl2溶液形成細霧狀的小液珠欲滴為止。待葉片表面的水分自然蒸發，CaCl2溶液完全被吸收后，再重復噴施1 次，每次噴施量相同。

1.3 測定項目與方法

葉片受害率測定：用目測的方法來評估葉片受害等級，見表1。

葉綠素a 熒光參數的測定：于9：00—11：00 時通過多功能植物效率分析儀（M-PEA，英國漢莎公司）測定每處理組中長勢相對一致的烤煙煙苗。將煙苗的第2片完全展開葉（從上往下數）進行30 min的暗適應后，測量葉片的初始熒光（Fo）、最大熒光（Fm）、電 子 傳遞 速率（ETR）、光 合 性 能 指 數（PIABS）；光化學反應集聚能量（ABS/RC），QA氧化還原反應消耗能量（TRo/RC），光化學反應中心捕獲的用于電子傳遞能量（ETo/RC）和光化學反應消耗能量（DIo/RC）。利用脈沖調制式熒光儀（FMS-2，英國漢莎公司）測量經過30 min 暗適應后第3 片完全展開葉的用于光化學反應量子產額（ΦPSII），類囊體膜兩側質子梯度和葉黃素循環介導的量子產額（ΦNPQ），基本的熒光量子產額和熱耗散量子產額（Φf，D）以及光化學反應失活熱耗散量子產額（ΦNF）。

表1 植株葉片受害等級的劃分Tab.1 Damage classification of plant leaves

1.4 數據處理

采用Microsoft Office Excel Statistical Package（Microsoft Office Excel，2013）軟件進行數據統計分析；采用One-Way ANOVA 分析和t 檢驗進行處理組與對照組的均值及差異顯著性檢驗，顯著性水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 酸雨脅迫下氯化鈣對烤煙葉片表觀特性的影響

由圖1 可見，不同pH 模擬酸雨濕沉降對烤煙葉片可造成不同程度的傷害。受害癥狀主要表現為葉緣與葉脈間產生黃棕色和黑褐色不規則的斑塊，頂端幼葉卷曲、皺縮。pH 5.5 酸雨處理的葉片無可見性傷害；pH 4.5 酸雨處理的葉片表現出輕微傷害，部分烤煙葉片中出現失綠斑點，受害等級為I；pH 3.5 酸雨處理導致葉片出現局部深紅色斑點和壞死斑點，斑點直徑約0.2 cm，受害面積約占總葉面積的20%，受害等級為Ⅱ。pH 2.5 酸雨處理造成葉片傷害最為嚴重，有80%以上的煙苗葉片上有傷斑出現，受害等級為IV。施加外源氯化鈣可減少酸雨脅迫對烤煙葉片造成的表觀傷害，葉片上失綠斑點減少。

圖1 酸雨脅迫下施加外源鈣對烤煙葉片表觀特性的影響Fig.1 Effects of exogenous CaCl2 on phenotype characteristics of flue-cured tobacco leaves under acid rain stress

2.2 酸雨脅迫下氯化鈣對烤煙葉片Fo、Fm、PIABS和ETR 的影響

圖2 表明，模擬酸雨濕沉降處理改變了烤煙幼苗葉片的Fo、Fm、PIABS和ETR。與CK 相比，pH 5.5 處理組的Fo、Fm和ETR 分別增加8.02%、4.39%和5.52%；而pH≤4.5 處理組的Fo、Fm、PIABS和ETR與CK 相比則顯著降低，說明重度酸雨抑制了烤煙葉片PSⅡ光化學反應，降低PSII 最初光能轉換效率以及電子傳遞速率，抑制光合作用的原初反應過程。而在酸雨脅迫下噴施氯化鈣溶液處理組葉 片 的Fo、Fm和PIABS顯 著 增 加，CK 和pH 5.5 時ETR 增加不明顯，pH≤4.5 時ETR 增加顯著，說明烤煙葉片噴施外源鈣能夠增加PSⅡ反應中心的活性。

2.3 酸雨脅迫下氯化鈣對烤煙葉片ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC 和ETo/RC 的影響

圖2 酸雨脅迫下氯化鈣對烤煙葉片Fo、Fm、PIABS和ETR 的影響Fig.2 Effects of exogenous CaCl2 on Fo，Fm，PIABS and ETR of flue-cured tobacco leaves under acid rain stress

圖3 酸雨脅迫下氯化鈣對烤煙幼苗葉片ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC 和ETo/RC 的影響Fig.3 Effects of exogenous CaCl2 on ABS/RC，DIo/RC，TRo/RC and ETo/RC of flue-cured tobacco leaves under acid rain stress

模擬酸雨濕沉降處理顯著提高了烤煙幼苗葉片的ABS/RC，DIo/RC 和TRo/RC，且酸雨pH越低，增加幅度越明顯，見圖3。圖3 表明，酸雨脅迫減少了烤煙葉片PS Ⅱ反應中心的數量，而剩余光化學反應集聚的能量和QA氧化還原反應消耗的能量增加。在酸雨脅迫下，pH≥3.5 時施加外源氯化鈣后烤煙葉片DIo/RC顯著增加。其中CK、pH 5.5、pH 4.5 和pH 3.5處 理 組 分 別 增 加17.32%（P＜0.05）、6.64%（P＜0.05）、6.48%（P＜0.05）和8.92%（P＜0.05），說 明施加外源鈣可增加烤煙葉片PS Ⅱ單位反應中心耗散的能量。

2.4 酸雨脅迫下氯化鈣對烤煙葉片PSⅡ反應中心吸收光能分配參數的影響

由 表2 可見，與CK 相比，pH 5.5 和pH 4.5 模擬酸雨濕沉降處理組烤煙葉片ΦPSⅡ有所增加，而ΦNPQ分 別 增 加8.49%和6.42%，ΦNF分 別 降 低64.71%和52.94%；pH 3.5 和pH 2.5 處理組烤煙葉片ΦPSⅡ分別降低25.47%和27.33%，與對照間差異達到顯著水平。說明pH≤3.5 的模擬酸雨濕沉降使更多的PSⅡ反應中心失活，PSⅡ的實際光化學效率降低。而酸雨脅迫下施用外源氯化鈣后，烤煙葉片ΦPSⅡ和Φf，D顯著增加，PSⅡ的實際光化學效率提高。

表2 酸雨脅迫下氯化鈣對烤煙葉片PSⅡ光化學反應吸收光能分配參數的影響①Tab.2 Effects of exogenous CaCl2 on photochemical parameters of PSⅡsystem in flue-cured tobacco leaves under acid rain stress

3 討論

本試驗中發現，pH≤4.5 模擬酸雨濕沉降處理的烤煙幼苗葉片Fo和Fm顯著降低，說明此時伸展葉片的PSⅡ反應中心在完全開放和完全關閉狀態時的葉綠素熒光產量均降低［27］。在施加外源氯化鈣后，PSⅡ反應中心的開放程度提高以保障類囊體膜上光合電子的正常傳遞，從而產生同化力用于碳的同化，這可能與Ca 可維持類囊體膜的穩定性有關。光合系統性能指數PIABS既可以反映原初光化學量子產額，也可反映出反應中心的密度和電子在PSI 和PSⅡ間的傳遞情況，以及光系統的活性，敏感性大于最大光化學效率Fv/Fm［28-29］。因此，將PIABS作為煙草對酸雨反應的有效熒光參數指標。本試驗中，pH≤4.5 模擬酸雨濕沉降處理葉片的PIABS顯著降低，進一步說明酸雨脅迫下誘導烤煙葉片電子傳遞受阻主要與PSⅡ受體側的功能被破壞有關。在酸雨脅迫下施加氯化鈣溶液后，處理組PIABS均顯著增加，說明施加外源氯化鈣提高了烤煙幼苗葉片PSⅡ的電子傳遞速率。酸雨濕沉降處理后烤煙幼苗反應中心的數量減少，迫使有活性的光化學反應的功能增加，這是植物在逆境條件下自我保護機制作用的結果。葉片施加氯化鈣后，PSⅡ剩余活性中心的效率提高。

植物光能的利用情況可用實際光化學效率（ΦPSⅡ）和非光化學淬滅系數（NPQ）來表示［30-31］。但高等植物體中NPQ 的增加是由于類囊體膜兩側質子梯度的建立和葉黃素的循環過程決定的［32］，NPQ 不能代表所有非光化學反應的淬滅過程。除光化學反應外，光呼吸、水-水循環和葉黃素循環等生理過程也會利用植物葉片吸收的光能［33-34］。因此，本試驗中將植物葉片葉綠素的激發能分為葉片PSⅡ光化學反應集聚的能量用于光化學反應的量子產額（ΦPSⅡ）、基本的熒光量子產額和熱耗散的量子產額（Φf，D）、PSⅡ光化學反應失活的熱耗散量子產額（ΦNF）以及類囊體膜兩側質子梯度和葉黃素循環介導的量子產額（ΦNPQ）4 個部分。本研究中發現，pH≥4.5 模擬酸雨的濕沉降處理烤煙葉片ΦPSⅡ、ΦNPQ以及Φf，D均明顯增加，說明輕度酸雨（pH≥4.5）處理有助于烤煙幼苗葉綠體中光誘導的質子吸收在類囊體兩側H+濃度梯度的建立，即類囊體膜兩側存在△pH，促進了葉綠體中ATP 合成，進而增強了葉黃素循環介導的光保護機能［35］。與此同時，利用熱能的形式耗散掉過剩的光能，避免了光合電子傳遞鏈受到過量激發能量的損壞，可減少過量激發能對PSⅡ反應中心的傷害。ΦNF所占比例呈下降趨勢，表明輕度模擬酸雨濕沉降處理后PSⅡ反應中心失活的比例下降。pH≤3.5 模擬酸雨濕沉降處理的烤煙幼苗葉片ΦPSⅡ和Φf，D所占比例下降，ΦNF所占比例顯著增加，說明重度酸雨阻礙了葉綠體中ATP 的合成，抑制了葉黃素循環介導的光保護機能的發揮，PSⅡ反應中心失活的比例大幅增加。葉片施加外源氯化鈣后，ΦPSⅡ和Φf，D增加，烤煙葉片用于光化學反應的量子產額以及PSⅡ的實際光化學效率提高，進而提高了煙草的光合效率。其原因：一是由于Ca2+能與類囊體膜中的磷脂分子結合，所形成的鈣鹽能維持膜的結構與功能，以此增強細胞膜結構的穩定性［36］；二是Ca2+還能與天線色素CP29 蛋白結合，改變CP29 蛋白的構象，并維持天線色素復合體的功能，避免蛋白復合體的脫離和解體［37］，從而保持光化學反應的順利進行。

4 結論

采用人工氣候箱培養煙苗，在酸雨棚中人工模擬酸雨脅迫條件下，pH 5.5 的輕度酸雨沒有影響葉片的表觀特征以及PSⅡ的結構和功能，并且在某種程度上有利于幼苗的生長；pH 4.5 的中度酸雨對葉片產生輕微的傷害，但光保護機制和PSⅡ反應中心活性沒有被破壞；pH≤3.5 的重度酸雨使葉片枯黃、出現失綠斑點，葉片吸收光能能力下降，PSⅡ受體側的功能被破壞，電子傳遞受到抑制，葉綠體中ATP 合成的動力降低，進而影響了PSⅡ反應中心的活性。而在酸雨脅迫條件下，葉面噴施10 mmol·L-1CaCl2溶液可增強光保護機能和提高光化學效率。