玉溪、許昌烤煙煙葉中淀粉酶基因的表達(dá)及酶活性分析

翟 妞，徐國(guó)云，鄭慶霞，何聲寶，張 慧，劉萍萍，許亞龍，陳千思，王 晨，周會(huì)娜*

1.中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號(hào) 450001

2.國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號(hào) 450001

淀粉是煙葉在生育期積累的主要碳水化合物，在鮮煙葉中的含量高達(dá)30%～40%［1］。淀粉含量是煙葉質(zhì)量評(píng)價(jià)的常規(guī)指標(biāo)之一，其水解產(chǎn)物含量的高低可直接影響煙葉的感官特性，同時(shí)還可通過(guò)美拉德反應(yīng)產(chǎn)生一系列煙葉香味成分［2］。烤煙煙葉在生育期需積累一定的淀粉，但烤后煙葉中殘留的淀粉則會(huì)影響煙葉的外觀和品質(zhì)［3］，因此要盡可能將其水解。在調(diào)制過(guò)程中，煙葉的大部分淀粉能被淀粉酶水解成糖類［4-5］，通過(guò)添加外源淀粉酶可使淀粉充分水解［2-3,6］。煙草中的淀粉酶主要為α-淀粉酶和β-淀粉酶，普遍存在于葉肉細(xì)胞中，能斷裂淀粉中的糖苷鍵［7］。

研究發(fā)現(xiàn)在云南、河南兩地，成熟期煙葉中的淀粉含量差異不大，但調(diào)制后云南煙葉中的糖含量明顯高于河南［8-9］。還發(fā)現(xiàn)在烘烤過(guò)程中，淀粉、可溶性糖與淀粉酶的活性高度相關(guān)［10］。本實(shí)驗(yàn)室人員前期研究發(fā)現(xiàn)，不同年份鮮煙葉中的淀粉含量存在較大波動(dòng)，云南鮮煙葉中的淀粉含量并不總是高于河南，但兩者烤后煙葉之間的糖含量差異則較為穩(wěn)定，表明高含糖量的云南煙葉可能與淀粉積累多、降解少有關(guān)（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。鑒于此，以河南許昌和云南玉溪成熟期烤煙中部鮮煙葉為研究對(duì)象，通過(guò)分析表達(dá)譜芯片中與淀粉降解相關(guān)的差異表達(dá)基因并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）驗(yàn)證，進(jìn)一步檢測(cè)淀粉酶活性、淀粉和總糖含量，旨在了解云南、河南兩地?zé)熑~中糖含量差異的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料

K326 采集于云南玉溪江川，中煙100 采集于河南許昌襄縣。采集年份為2013 和2018 年。上午10 點(diǎn)采集成熟期第10 葉位葉片（從上往下），立即冷凍于液氮中，-80 ℃保存。

1.1.2 試劑

植物RNA 提取試劑盒（貨號(hào)：RN38）購(gòu)自北京艾德萊生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)：RR047A）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限責(zé)任公司；熒光定量PCR 試劑盒FastStart Universal SYBR Green Master（貨號(hào)：4913914001）購(gòu)自美國(guó)Roche公司；蛋白定量試劑盒PierceTMBCA Protein Assay Kit（貨號(hào)：23225）購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；α-淀粉酶活性檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：A081647-S）和β-淀粉酶活性檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：A09215-S）購(gòu)自上海晶抗生物科技有限公司。其他常規(guī)試劑均為上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司分析純?cè)噭Ｒ镉缮ど铮ㄉ虾＃┕こ逃邢挢?zé)任公司合成。

1.1.3 儀器

PL-602L 電 子 天 平（瑞 士Mettler Toledo 公司）；電子天平MS105（瑞士Mettler Toledo 公司）；冷凍臺(tái)式離心機(jī)5424R（德國(guó)Eppendorf 公司）；超聲波破碎儀VCX130（美國(guó)Sonnics 公司）；超微量分光光度計(jì)Nanodrop 2000（美國(guó)Thermo 公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀LightCycler?96（美國(guó)Roche 公司）；酶標(biāo)儀SpectraMax plus 384（美國(guó)MD 公司）；烘箱FD115（德國(guó)Binder 公司）；連續(xù)流動(dòng)分析儀AA3（英國(guó)Seal 公司）。

1.2 方法

1.2.1 煙葉cDNA 制備

將煙葉在液氮中充分研磨后，按照植物RNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行RNA 提取。利用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 質(zhì)量，RNA 濃度≥50 μg/mL、OD260/OD280在1.8～2.0 之 間。將RNA 反 轉(zhuǎn) 錄 成cDNA，用于qPCR 分析。反轉(zhuǎn)錄體系和反應(yīng)條件參考張慧等［11］方法。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）

qPCR 擴(kuò)增體系：10 μL 2×SYBR Green Master，10 μmol/L 正反向引物各0.5 μL，2 μL 稀釋10 倍的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，ddH2O 補(bǔ)至20 μL。

qPCR 反應(yīng) 條 件：95 ℃10 min；95 ℃10 s，58 ℃15 s，72 ℃15 s，40 個(gè) 循 環(huán)；95 ℃5 s，65 ℃1 min，以0.1 ℃/s 升溫至97 ℃。β-actin 為內(nèi)參基因，每個(gè)基因各重復(fù)3 次。根據(jù)CT值計(jì)算基因的變化倍數(shù)，具體參考張慧等［11］方法。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.3 煙葉總蛋白的提取及定量

將保存于-80 ℃的煙葉樣品在液氮中充分研磨，置于1.5 mL EP管液氮預(yù)冷后，取0.1 g加入1 mL提取緩沖液NE。渦旋振蕩混勻后，冰上靜置1 h。5 000 r/min 離心20 min 后，取上清液，即為蛋白提取液。

取10-1倍的蛋白提取液，按照BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線、樣品吸光值得到蛋白含量。

蛋白濃度（μg/μL）=［蛋白含量/稀釋液總體積］×稀釋倍數(shù)。

蛋白 提 取NE 緩 沖 液：20 mmol/L Hepes（pH 7.5），40 mmol/L KCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF。

1.2.4 淀粉酶活性的檢測(cè)

同一試驗(yàn)田采集6 份煙葉樣品，每份樣品重復(fù)3 次。將每份樣品的蛋白提取液按照α-和β-淀粉酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行T 檢驗(yàn)。

α-或β-淀粉酶活性（U/μg 全蛋白）=樣品的活性濃度×上樣體積/上樣蛋白總量。

1.2.5 煙葉總糖、淀粉含量的檢測(cè)

同一試驗(yàn)田采集6 份煙葉混合樣品，作為6 次重復(fù)。采用YC/T 159—2002［12］方法測(cè)定煙葉總糖含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）；采用YC/T 216—2013［13］方法測(cè)定煙葉淀粉含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。對(duì)結(jié)果進(jìn)行T檢驗(yàn)。

1.2.6 基因芯片分析

芯片制備由國(guó)家煙草基因研究中心和美國(guó)Affymetrix 公司完成，具體芯片信息參照“煙草SNP 芯片研制及標(biāo)準(zhǔn)、典型表達(dá)圖譜繪制”的技術(shù)報(bào)告（數(shù)據(jù)未公開）。芯片檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析由北京博奧生物有限公司和國(guó)家煙草基因研究中心完成。

使用R 語(yǔ)言affy 芯片數(shù)據(jù)分析包中的rma 函數(shù)對(duì)芯片進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，然后對(duì)典型香型煙草中玉溪和許昌樣品進(jìn)行分組并使用T 檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，利用R 語(yǔ)言中p.adjust 函數(shù)對(duì)T 檢驗(yàn)結(jié)果中的P 值進(jìn)行Bonferroni 矯正，選取玉溪、許昌兩地?zé)熑~中表達(dá)差異倍數(shù)大于2 的基因，矯正后P＜0.05 為差異基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉溪、許昌煙葉中淀粉和總糖含量分析

分析2013 年許昌、玉溪成熟期烤前煙葉中淀粉和總糖含量（圖1），發(fā)現(xiàn)玉溪、許昌煙葉中淀粉含量分別為33.00%、35.00%，二者沒有顯著差異。而總糖含量，玉溪煙葉（2.10%）明顯低于許昌煙葉（3.20%）。在全國(guó)煙葉質(zhì)量與品種試驗(yàn)數(shù)據(jù)庫(kù)（http://10.6.0.81/）中，2013 年玉溪、許昌烤后煙葉淀粉含量分別為5.65%、4.16%，總糖含量分別為36.46%、20.6%，烤后煙葉中總糖含量玉溪明顯高于許昌。推測(cè)在煙葉成熟到烘烤過(guò)程中，淀粉降解是否充分對(duì)烤后煙葉中的總糖含量起到關(guān)鍵作用。

圖1 玉溪和許昌煙葉中的淀粉和總糖含量Fig.1 Contents of starch and total sugar in tobacco leaves from Yuxi and Xuchang

2.2 2013 年玉溪、許昌煙葉中淀粉降解相關(guān)基因的篩選及表達(dá)量驗(yàn)證

在玉溪和許昌成熟期中部煙葉2013 年的表達(dá)譜芯片中，涉及淀粉降解的基因有12 個(gè)，分別為Ntab0658590、 Ntab0621070、 Ntab0910040、Ntab0174330、 Ntab0838220、 Ntab0077560、Ntab0169680、 Ntab0811610、 Ntab0938990、Ntab0084570、Ntab0282340 和Ntab0282870。在 玉溪和許昌兩地，有4 個(gè)表達(dá)量有顯著差異的淀粉酶基因，分別是2 個(gè)α-淀粉酶基因（Ntab0174330 和Ntab0838220）和2 個(gè)β-淀粉酶基因（Ntab0811610和Ntab0938990），這4 個(gè)基因在玉溪煙葉中表達(dá)量較高。qPCR 結(jié)果（圖2）表明，4 個(gè)基因中Ntab0938990 的表達(dá)量最高，Ntab0174330 的表達(dá)量最低。表達(dá)量高低依次為Ntab0938990＞Ntab0838220＞Ntab0811610＞Ntab0174330。

圖2 玉溪和許昌煙葉中4 個(gè)淀粉酶基因的表達(dá)Fig.2 Expressions of four amylase genes in tobacco leaves from Yuxi and Xuchang

2.3 2013 年玉溪與許昌煙葉中淀粉酶活性的差異

煙草葉片主要通過(guò)α-淀粉酶和β-淀粉酶將淀粉降解成糖類。在已報(bào)道的文獻(xiàn)中［1,4-7］主要關(guān)注于α-和β-淀粉酶，鮮有淀粉酶基因的相關(guān)報(bào)道。基因芯片及qPCR 結(jié)果（2.2 節(jié)）表明，在玉溪和許昌煙葉中有4 個(gè)差異表達(dá)的淀粉酶基因。為此，進(jìn)一步檢測(cè)玉溪和許昌煙葉中α-和β-淀粉酶的活性。在2013 年，許昌和玉溪成熟期中部煙葉中α-和β-淀粉酶活性結(jié)果（圖3）表明，兩地?zé)熑~中α-和β-淀粉酶的活性變化趨勢(shì)一致，即均在玉溪煙葉中較高，分別是許昌煙葉的2.6 和2.2 倍。

2.4 玉溪、許昌煙葉中淀粉酶基因表達(dá)和活性的年份差異

圖3 玉溪和許昌煙葉中α-和β-淀粉酶的活性（2013 年）Fig.3 Activities of α-and β-amylases in tobacco leaves from Yuxi and Xuchang(2013)

為分析不同年份間玉溪和許昌煙葉中淀粉酶基因的表達(dá)及其酶活性的差異，于2018 年重新對(duì)兩地?zé)熑~進(jìn)行α-和β-淀粉酶基因的表達(dá)及其酶活性的分析。與2013 年相比，在2018 年玉溪煙葉中，α-淀粉酶基因（Ntab0174330、Ntab0838220）和β-淀粉酶基因（Ntab0811610、Ntab0938990）的表達(dá)量明顯高于許昌煙葉（圖4）。同時(shí)檢測(cè)了兩地?zé)熑~樣品中α-和β-淀粉酶活性，發(fā)現(xiàn)玉溪煙葉中的α-淀粉酶活性（5.10×10-5U/μg 全蛋白）和β-淀粉酶活性（1.50×10-4U/μg 全蛋白）都高于許昌煙葉（4.70×10-5U/μg 全蛋白，1.30×10-4U/μg 全蛋白）（圖5）。在全國(guó)煙葉質(zhì)量與品種試驗(yàn)數(shù)據(jù)庫(kù)（http://10.6.0.81/）中，2018 年玉溪、許昌烤后煙葉淀粉含量分別為4.10%、4.49%，總糖含量分別為32.18%、24.97%，烤后煙葉中總糖含量玉溪明顯高于許昌。綜上，兩個(gè)年份之間，玉溪和許昌煙葉中淀粉酶基因的表達(dá)和酶活性以及烤后煙葉中總糖的變化趨勢(shì)一致。

圖4 玉溪和許昌煙葉中α-和β-淀粉酶基因的表達(dá)（2018 年）Fig.4 Expressions of α-and β-amylase genes in tobacco leaves from Yuxi and Xuchang(2018)

圖5 玉溪和許昌煙葉中α-和β-淀粉酶的活性（2018 年）Fig.5 Activities of α-and β-amylases in tobacco leaves from Yuxi and Xuchang(2018)

3 討論

淀粉含量是煙葉質(zhì)量評(píng)價(jià)的常規(guī)指標(biāo)之一，淀粉降解產(chǎn)物中糖含量的高低直接影響煙葉的感官品質(zhì)。從鮮煙葉看，玉溪煙葉中的淀粉含量和許昌沒有顯著差異，總糖含量玉溪低于許昌；而在烤后煙葉中，玉溪煙葉中的總糖含量明顯高于許昌煙葉。對(duì)比兩地?zé)熑~烤前、烤后的總糖含量，推測(cè)玉溪、許昌兩地?zé)熑~的淀粉降解存在差異，玉溪煙葉在烘烤過(guò)程中淀粉降解較為充分，而許昌煙葉的淀粉降解不太充分。而淀粉酶在淀粉降解過(guò)程中起關(guān)鍵作用，玉溪和許昌煙葉在烘烤過(guò)程中淀粉降解的差異，可能與兩地?zé)熑~中淀粉酶的活性有關(guān)。本研究結(jié)果證實(shí)了這一推論，明確了4個(gè)在玉溪和許昌煙葉中表達(dá)量具有顯著差異的淀粉酶基因，即α-淀粉酶基因Ntab0174330、Ntab0838220 和β-淀 粉 酶 基 因Ntab0811610、Ntab0938990。同時(shí)檢測(cè)玉溪和許昌煙葉中的α-和β-淀粉酶活性，結(jié)果表明玉溪煙葉中α-和β-淀粉酶活性都高于許昌煙葉。

近年來(lái)，煙葉中淀粉酶基因及淀粉酶活性被逐漸關(guān)注［14］。通過(guò)分析云南玉溪和河南許昌煙葉中淀粉酶活性的差異和淀粉酶基因表達(dá)的差異，結(jié)合兩地?zé)熑~烤前、烤后的淀粉和總糖含量差異，發(fā)現(xiàn)淀粉酶在烤后煙葉總糖含量中起著關(guān)鍵作用，而不是烤前煙葉的淀粉積累量。已有研究結(jié)果表明，在煙葉烘烤過(guò)程中通過(guò)添加外源淀粉酶可促使淀粉充分降解［2-3,6］。宮長(zhǎng)榮等［15］研究表明，河南煙葉在烘烤過(guò)程中β-淀粉酶的活性最高。在后續(xù)研究中，可根據(jù)本研究結(jié)果，以α-淀粉酶基因Ntab0174330、Ntab0838220 和β-淀粉酶基因Ntab0811610、Ntab0938990 為目標(biāo)基因，尤其是β-淀粉酶基因Ntab0938990（在兩地中表達(dá)量都最高），在煙草中構(gòu)建超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，為分子輔助育種提供材料。

4 結(jié)論

①玉溪、許昌兩地鮮煙葉中的淀粉含量差異不顯著。②4 個(gè)淀粉酶基因在玉溪煙葉中的表達(dá)量較高，即α-淀粉酶基因Ntab0174330、Ntab0838220和β-淀粉酶基因Ntab0811610、Ntab0938990。③玉溪鮮煙葉中的α-和β-淀粉酶活性高于許昌煙葉。兩個(gè)年份數(shù)據(jù)表明，玉溪、許昌兩地?zé)熑~中的α-和β-淀粉酶活性變化趨勢(shì)一致。