基質匹配溶劑校準-GC-MS/MS法測定卷煙主流煙氣B[a]P

廖惠云，王 瑞，張 華，吳 洋，曹 毅，張 媛，王晨輝

江蘇中煙工業有限責任公司,南京市建鄴區興隆大街29 號 210019

苯并［a］芘（B［a］P）是行業關注的卷煙煙氣7 種代表性有害成分之一［1-5］。在量化分析煙氣B［a］P過程中，由于復雜煙氣成分帶來的干擾，加之目標物在煙氣中的釋放量處于納克級的水平，特別是低焦油卷煙煙氣中目標物的釋放量可能更低。因此，如何有效去除卷煙煙氣復雜基質的干擾，快速、準確測定其中的B［a］P 是煙氣分析研究的熱點［6-8］。

相較于現行國標GB/T 21130—2007［9］的方法，有不少科研工作者對其量化分析進行優化研究，比如周仕祿等［10］、史佳沁等［11］、邊照陽等［12］、尉朝等［13］、王春蘭等［14］、段沅杏等［15］、陳曉水等［16］、王晶等［17］、申欽鵬等［18］先后對樣品前處理過程或質譜儀器進行改進完善，以期達到簡化樣品前處理、提高分析準確度的目的。其中為了提高操作效率，采用氣相色譜-串聯質譜（GC-MS/MS）方法，將樣品萃取液直接進樣分析成為一種技術選擇，但實際驗證結果表明，受基質效應影響,目標物的回收率偏低?？陀^說來，這些分析方法對于大批量樣品的快速、準確測定仍有待完善之處。因此，在參考相關文獻［19-21］的基礎上，建立了采用基質匹配溶劑配制標準溶液，樣品萃取溶液直接進樣，使用GC-MS/MS 測定卷煙主流煙氣B［a］P 釋放量的方法，旨在為卷煙煙氣中痕量B［a］P 的定量分析提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

18 個不同盒標焦油量的市售卷煙（其中1#～5#樣品為細支卷煙，6#～18#樣品為常規圓周卷煙）；卷煙煙氣分析用1#標準樣品。

環己烷、甲醇、二氯甲烷（色譜純，德國CNW公司）；氘代苯并［a］芘（B［a］P-d12）、苯并［a］芘（標準品，≥98%，德國Dr.Ehrenstorfer 公司）；500 mg/6 mL 硅膠固相萃取柱（上海安譜科學儀器有限公司）。

6890N/5975C 氣相色譜-質譜聯用儀、7890A/7000B 氣相色譜-三重串聯四極桿質譜聯用儀（美國Agilent 公司）；RM 20H 全自動吸煙機（德國Borgwaldt KC 公司）；HY-5A 回旋振蕩器（常州國華電器有限公司）；KQ-500DE 超聲波發生器（昆山市超聲儀器有限公司）；R-215 旋轉蒸發儀（瑞士Büchi 公司）；T201 電子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo 公司）。

1.2 方法

1.2.1 標準工作溶液的配制

（1）內標溶液和標準儲備液

準確稱取內標物B［a］P-d12，使用環己烷為溶劑配制濃度為320 ng/mL 的內標溶液；準確稱取目標物B［a］P，使用環己烷為溶劑配制濃度為200 ng/mL 的標準儲備液。

（2）基質匹配溶劑

按GB/T 19609—2004［22］的要求收集20 支卷煙煙氣分析用1#標準樣品的煙氣總粒相物，添加40 mL 環己烷，于振蕩器上160 r/min 條件下萃取40 min，靜置片刻，得萃取液。在對萃取液進行處理前，先對固相萃取柱進行活化，即用5 mL 甲醇進行淋洗，排干，再用10 mL 環己烷平衡，柱子篩板上保留少量環己烷。然后用活化好的固相萃取柱制備基質匹配溶劑，即準確移取10 mL 萃取液至活化好的固相萃取柱，待萃取液全部移至固相萃取柱的填料后，先用環己烷分3 次、每次10 mL 進行淋洗，再用二氯甲烷分3 次、每次10 mL 進行淋洗，棄去淋洗液；最后用10 mL 甲醇進行洗脫，收集洗脫液，視為基質匹配溶劑。

（3）標準工作溶液

分別準確移取標準儲備液50、100、200、500 和1 000 μL，以及內標溶液各250 μL，用基質匹配溶劑稀釋定容至10 mL 容量瓶中。該系列標準工作溶液B［a］P 濃度分別為1、2、4、10 和20 ng/mL，其中內標B［a］P-d12濃度為8 ng/mL。

1.2.2 樣品處理與分析

按照GB/T 16450—2004［23］的要求收集20 支卷煙的總粒相物。將收集有20 支卷煙總粒相物的玻璃纖維濾片放入100 mL 錐形瓶中（濾片應整片放入錐形瓶內鋪平，不能剪碎或撕碎），準確移入1 mL 內標溶液于濾片上，并移入40 mL 環己烷，置于振蕩器上于160 r/min 條件下萃取40 min，靜置片刻。將萃取液過0.45 μm 有機相濾膜，將濾液直接進行GC-MS/MS 分析。分析條件為：

色譜柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度：280 ℃；進樣量：2 μL；進樣方式：脈沖不分流進樣，進樣壓力172.37 kPa，持續時間0.75 min；載氣：氦氣，恒流速度1.2 mL/min；程序升溫℃（20 min）；傳輸線溫度：280 ℃；電離方式：EI 源，正離子模式；離子源溫度：300 ℃；四極桿溫度：均為180 ℃；碰撞氣：氮氣，流速1.5 mL/min，載氣（氦氣）流速2.25 mL/min；多反應監測（MRM）模式，詳細參數見表1。

2 結果與討論

2.1 基質匹配溶劑制備考察

前期驗證實驗表明，使用環己烷作配標溶劑、應用GC-MS/MS 分析B［a］P 時，受基質效應影響，煙氣中目標物的回收率偏低。因此，基質效應是采用MS 法分析煙氣中B［a］P 時必須考慮的問題。基質效應通常不能被消除，但一般可采用SPE凈化、稀釋樣品提取液、采用合適的內標、標準加入法以及配制基質匹配標準溶液等［24］措施來減小其對量化分析的影響。對比現行國標方法［9］采取的措施，本著簡化樣品前處理過程的目的，本研究中采用配制基質匹配標準溶液的方法來減小基質效應的影響，具體思路為：使用硅膠固相萃取柱凈化樣品溶液時，上樣液和淋洗液經接收合并、濃縮后用于MS 分析，而樣品溶液中其余物質被吸附保留在固相萃取柱中，理論上被視為干擾基質。在盡可能與樣品溶液中目標物存在的基質環境保持一致情況下，該部分物質經洗脫下來，再經稀釋后制成基質匹配溶劑，用于配制基質匹配標準溶液。

表1 目標物的MRM 參數Tab.1 MRM parameters of B［a］P and B［a］P-d12

圖1 不同淋洗條件下B［a］P 的提取離子對色譜圖Fig.1 Ion-pairs chromatograms of B［a］P under different eluent volume conditions

為此，先行考察B［a］P 在硅膠固相萃取柱的保留行為，以期制備合適的基質匹配溶劑。具體過程為：按照1.2 節的方法，參照GB/T 21130—2007［9］的方法加入30 mL 環己烷進行淋洗，收集淋洗液并濃縮至1 mL，溶液中目標物的色譜圖見圖1a；再用二氯甲烷分4 次、每次10 mL 進行淋洗，分別收集淋洗液并濃縮至1 mL，溶液中目標物色譜圖見圖1b～圖1e。色譜圖1a～圖1e 中B［a］P 的峰面積依次為319 715、5 114、2 488、1 486 和0（因色譜圖1e中目標物的S/N 小于10，視為未檢出），可見使用30 mL 環己烷和30 mL 二氯甲烷才能使目標物被完全洗脫。理論上，B［a］P 的辛醇-水分配系數lg KOW為6.04，屬于非極性化合物，在硅膠固相萃取柱中是不易保留的。實際檢測結果表明，用環己烷淋洗后，B［a］P 在柱子中仍有少許保留。所以在制備基質匹配溶劑時，依次用30 mL 環己烷、30 mL 二氯甲烷為溶劑淋洗萃取液，棄去淋洗液，最后直接用10 mL 甲醇洗脫，收集全部洗脫液，視為基質匹配溶劑，用于配制標準工作溶液。

2.2 儀器條件優化

2.2.1 進樣方式優選

基于煙氣中B［a］P 釋放水平及其在萃取液中的稀釋程度，為提高響應情況，在痕量分析中可加大進樣量來提高靈敏度。一般來講，溶劑在襯管內氣化后有較大膨脹體積，普通壓力下進樣有體積限制。為此可使用脈沖模式，用以提高實際進入色譜柱的樣品量，使氣化后的樣品更多進入色譜柱進而提高檢測靈敏度；同時由于本方法中采用了脈沖進樣，使得進樣口壓力變大，在溶劑膨脹體積和襯管體積允許條件下，將進樣量由通常的1 μL 改為2 μL。在保持其他條件不變的情況下，研究進樣方式對目標物響應的影響。圖2a～圖2d 依次為分流（分流比為10∶1）、脈沖分流（分流比為10∶1）、不分流及脈沖不分流等進樣方式下目標物出峰情況?？梢钥闯?，4 種進樣方式下，B［a］P 出峰情況總體較好，峰形對稱，基線完全分離。相比于分流條件而言，不分流條件下目標物峰面積更大，同時信噪比也有一定程度提高。在不分流條件下，相比單純不分流而言，脈沖不分流條件下的目標物峰面積、信噪比均顯著提高。因此，考慮目標物整體出峰狀況，優選脈沖不分流為色譜進樣方式。

圖2 進樣方式對B［a］P 出峰情況的影響Fig.2 Effect of injection mode on chromatogram peak of B［a］P

2.2.2 離子對及碰撞能量的確定

圖3 全掃描模式下B［a］P（a）和B［a］P-d12（b）的質譜圖Fig.3 Mass spectra of B［a］P（a）and B［a］P-d12（b）under full scan mode

以高濃度標準工作溶液為對象，通過全掃描模式選擇合適的母離子，B［a］P 和B［a］P-d12的質譜圖如圖3 所示?？梢钥闯?，B［a］P 分子離子（也就是其基峰離子）為m/z 252，B［a］P-d12分子離子（也就是其基峰離子）為m/z 264。因此，分別選擇m/z 252 和m/z 264 為B［a］P 和B［a］P-d12的母離子。進一步分析，由于B［a］P 極性很小、結構非常穩定，不同碰撞能量產生的質譜圖差異較大，因此在5～60 eV 碰撞能量范圍條件下，采用產物離子掃描模式進行檢測，以此優選產物離子及其碰撞能量。結果顯示：碰撞能量小于30 eV 時，相對于母離子豐度，B［a］P 產生碎片離子的豐度均小于其10%；碰撞能量大于30 eV 時，B［a］P 母離子產生碎片離子豐度顯著增大，特別是碰撞能量大于40 eV 時，母離子更大程度被打碎，產生的基峰離子為m/z 250。綜合考慮各離子響應情況，確定B［a］P 的定量離子為m/z 250，輔助定性離子為m/z 226，各自優化的碰撞能量分別為50 eV 和30 eV。同理，可確定B［a］P-d12定量離子為m/z 260，輔助定性離子為m/z 236，各自優化的碰撞能量分別為50 eV 和40 eV。

2.2.3 質譜溫度參數優選

考慮到最低基質配標工作溶液中B［a］P 濃度僅為1 ng/mL，當質譜儀器離子源和四極桿為常用溫度時，目標物響應值低且峰形不好，對B［a］P的定量分析有一定影響。為此，以1 ng/mL 最低標樣溶液為對象，探討高離子源和四極桿溫度（分別為300、180 ℃）以及常用溫度條件下目標物出峰情況，具體結果見圖4 和圖5。可以看出，相比于常用溫度質譜參數，高溫質譜參數下B［a］P 和B［a］P-d12的背景信號稍微有所增加，但目標物峰形總體情況更好，峰形對稱且不拖尾，信噪比提高，響應信號增強。綜合考慮質譜儀器離子源溫度極限值，兼顧離子源使用壽命以及定量分析結果的準確性，優選離子源和四極桿溫度分別為300 ℃和180 ℃。

2.3 樣品前處理優化

2.3.1 萃取液處理過程優選

圖4 不同質譜溫度條件下B［a］P 的提取離子對色譜圖Fig.4 Ion-pairs chromatograms of B［a］P at different mass temperatures

圖5 不同質譜溫度條件下B［a］P-d12的提取離子對色譜圖Fig.5 Ion-pairs chromatograms of B［a］P-d12 at different mass temperatures

對于卷煙主流煙氣B［a］P 的分析而言，因其釋放量較低，需經過富集和分離等過程，易對檢測結果帶來影響。基于此，充分利用GC-MS/MS 儀器MRM 采集模式下復雜基質中目標物響應靈敏的特點，直接采用萃取溶液進行儀器分析，得到的典型樣品溶液色譜圖如圖6a 所示。可以看出，B［a］P 峰形對稱，能夠與基線完全分離，基線噪聲趨近于零，雜質干擾峰較少。采用現行國標方法［9］得到的色譜圖（圖6b），B［a］P 峰形對稱，能夠與基線完全分離，但是基線噪聲較大，雜質干擾峰較多，信噪比相較本方法更低。由此可見，在采用GC-MS/MS 法分析時，即使直接使用萃取液進樣，目標物依然能夠精確定量，并且整體出峰情況優于現行國標方法。更為重要的是，樣品前處理大為簡便，無需對萃取液進行凈化、濃縮等過程，節省了有機溶劑。

圖6 不同前處理條件下B［a］P 的總離子流色譜圖Fig.6 TIC chromatogram of B［a］P under different sample processing conditions

2.3.2 提取方式選擇

按照現行國標方法［9］進行B［a］P 分析，采用超聲萃取進行提取時，隨提取時間的延長，超聲波發生器內水溫升高，受環己烷沸點低的影響，錐行瓶內氣相壓力增大，給前處理操作帶來負面影響。為此，以15#卷煙樣品為對象，使用GC-MS/MS 方法，將萃取溶液直接進樣檢測分析，比較了超聲和振蕩兩種萃取方法對檢測結果的影響，結果見表2。可以看出，隨萃取時間的延長，兩種萃取方式對B［a］P 檢測結果影響的變化趨勢較為一致，即先逐漸增大，到40～50 min 左右趨于峰值。綜合考量檢測結果和操作效率，選擇提取方式為振蕩萃取，萃取時間為40 min。

表2 萃取方式對B［a］P 檢測結果的影響Tab.2 Influence of extraction method on results of B［a］P detection （ng·支-1）

2.4 方法學考察

將系列標準溶液進行GC-MS/MS 分析，求得線性回歸方程及其相關參數?；貧w方程為Y=1.56X-0.010，決定系數R2為0.999 6，目標物在1.04～20.8 ng/mL 濃度范圍內呈線性關系。以基質配標得到的最低濃度標樣為對象，平行測定9 次，求其標準偏差；分別以3 倍和10 倍標準偏差對應的結果為方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ），計算得LOD 和LOQ 分別為0.14 ng/支和0.46 ng/支，結果顯示本方法比現行國標方法［9］更為靈敏。

分別以不同盒標焦油量的1#和6#卷煙樣品為對象，依次進行日內精密度和日間精密度實驗，計算6 次平行測定結果的相對標準偏差（RSD），結果如表3 所示。可以看出，本方法的日內RSD 介于3.13%～3.80%之間，日間RSD 介于5.41%～6.94%之間。在含有目標物的玻璃纖維濾片中分別加入低、中、高3 個水平的標準溶液，進行加標回收實驗，結果見表4?？梢钥闯?，低、中、高3 個水平的加標回收率在94.62%～104.81%之間。本方法具有較好的精密度和準確度，能夠滿足煙氣中痕量目標物的定量分析。

表3 方法的精密度Tab.3 Precision of the method

表4 方法的回收率Tab.4 Recoveries of the method

2.5 與現行國標方法的比較

分別采用本方法和現行國標方法測定了18 個不同盒標焦油量的細支和常規卷煙樣品主流煙氣B［a］P 釋放量，結果見表5。可以看出，相比于現行國標方法，本方法檢測結果的相對偏差均在±10%以內。采用SPSS 軟件對兩種方法的測定結果進行配對t 檢驗，結果表明，選取置信度為95%時，Sig.=0.216（＞0.05），說明兩種方法的測定結果不存在顯著性差異。由此可見，對于痕量目標物的定量分析而言，兩種方法的一致性較好。

表5 不同盒標主流煙氣焦油釋放量卷煙樣品的實際檢測結果Tab.5 Determination results of cigarette samples with different labeled tar levels from mainstream smoke

3 結論

①采用樣品萃取溶液直接進樣方式，建立了基質匹配曲線-GC-MS/MS 法快速測定卷煙主流煙氣B［a］P 的方法，回收率為94.62%～104.81%，RSD 介于3.13%～6.94%之間，檢出限為0.14 ng/支，定量限為0.46 ng/支。②樣品對比分析表明，本方法與現行國標方法的測定結果基本一致。③本方法具有操作簡便、耗費溶劑少、靈敏度高等優點，為準確、快速測定卷煙主流煙氣B［a］P 釋放量提供了新方法。