煙草纈氨酸對主流煙氣成分的貢獻

申麗霞，郭吉兆，田海英，王紅霞，許淑紅，洪金華，邱建華*

1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2 號 450001

2.浙江中煙工業有限責任公司寧波卷煙廠，浙江省寧波市奉化區葭浦西路2001 號 315040

3.河南中煙工業有限責任公司技術中心，鄭州經濟技術開發區第三大街9 號 450016

氨基酸是煙草中一類重要的含氮化合物，與煙葉品質密切相關［1-3］。卷煙燃吸時，氨基酸熱解或參與美拉德反應產生部分煙氣成分［4］，研究煙草氨基酸對煙氣的影響對于調控卷煙煙氣成分具有重要意義。許多研究采用高溫熱解實驗模擬卷煙燃吸，根據熱解產物推測氨基酸對卷煙煙氣成分的影響，結果表明氨基酸熱解可產生氰化氫、腈類、氨、吡啶類、吡咯類和吡嗪類等含氮化合物［5-7］。共存基質對氨基酸熱解產物的種類、相對質量分數均有顯著影響［8-9］，如：葡萄糖可促進天冬酰胺熱解時氰化氫的生成、抑制氨的形成［10］；果糖和脯氨酸共熱解產生1-羥基丙酮、吡咯烷、1-甲酰基吡咯烷、1-乙酰基吡咯烷等單獨熱解時不產生的化合物［11］。卷煙燃吸時多種組分共存，且卷煙燃吸時溫度、氣氛條件變化復雜，簡單熱解條件下所得熱解產物與卷煙實際燃燒產生的有較大差異［12］。以同位素標記化合物進行卷煙添加，考察煙氣中同位素標記成分的分布，不但可以使化合物熱解條件與卷煙正常燃吸基本一致，同時由于同位素標記產物檢測的高選擇性，可采用較低的添加水平，避免對卷煙基質造成顯著影響［13-14］。

纈氨酸在烤煙煙葉中的質量分數可高達769 μg/g［15］，是烤煙煙葉中質量分數較大的氨基酸。同時，纈氨酸也被國外煙草行業用作煙草添加劑［16］。本研究中以烤煙型卷煙為基質，通過在煙絲中添加13C5-15N-纈氨酸，采用GC/MS 法進行煙氣分析，明確主流煙氣中與纈氨酸相關的化學成分并確定量效關系，旨在明確纈氨酸對卷煙品質影響的物質基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

烤煙煙絲（產地：遵義；等級：C3F；年份：2016），該煙絲纈氨酸質量分數為325 μg/g；卷煙空筒［圓周：24.1 mm；長度：（24+60）mm；無濾嘴通風］。

13C5-15N-纈氨酸（98%，美國Sigma 公司）；D-(+)-葡萄糖、L-纈氨酸（99%，百靈威科技有限公司）；乙酸苯乙酯（98%，英國Alfa Aesar 公司）；二氯甲烷（色譜純，美國Avantor 公司）；甲醇（色譜純，美國Dikma 公司）；苯-d6（99.5%，美國CIL公司）。

SM450-PC107 直線型吸煙機（英國Cerulean 公司）；5250T 熱解儀（美國CDS 公司）；7890B/5977A氣相色譜/質譜聯用儀（美國Agilent 公司）；CPA225D 電子天平（感量0.000 01 g，德國Sartorius公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

稱取60 g 煙絲樣品，在相對濕度（60±2）%、溫度（22±1）℃的環境中平衡48 h。稱取為煙絲實際質量分數4 倍的13C5-15N-纈氨酸，將其溶解于6.0 g 水中，然后將氨基酸溶液均勻噴灑于煙絲上。將上述煙絲樣品裝入自封袋，密封，平衡40 min；然后將其于110 ℃的烘箱中干燥2 min。將烘后的煙絲裝入自封袋中，密封后冷卻至室溫，得到添加量為煙絲實際質量分數4 倍的同位素標記氨基酸煙絲樣品。對照煙絲樣品以空白煙絲添加同樣量的水，采用相同的處理方式制作。

將煙絲置于相對濕度（60±2）%、溫度（22±1）℃的環境中平衡48 h，手工卷制成煙支。每組樣品中挑選吸阻范圍為（平均值±49）Pa 和質量范圍為（平均值±0.015）g 的煙支作為測試煙支。

1.2.2 煙氣成分分析

煙氣分析參考文獻［14］的方法。按照ISO 標準條件［17］抽吸卷煙，采用44 mm 劍橋濾片、串聯兩個含有10 mL 甲醇的吸收瓶進行煙氣粒相和氣相成分捕集。卷煙抽吸結束后，采用含有內標（乙酸苯乙酯和氘代苯）的二氯甲烷溶液超聲萃取粒相物，萃取液過0.45 μm 濾膜，將濾液用GC/MS 法分析煙氣粒相成分。兩個吸收瓶中分別加入含有相同質量分數內標的二氯甲烷溶液，各取1 mL 混合后，采用GC/MS 法分析煙氣氣相成分。質譜采集采用全掃描監測模式，掃描范圍為25～400 amu。

1.2.3 熱解實驗

分別稱取180 mg 葡萄糖、120 mg 纈氨酸，置入研缽中共研、混合均勻，作為葡萄糖和纈氨酸的混合物（摩爾比約為1∶1）。各稱取0.92 mg 葡萄糖、0.97 mg 纈氨酸以及1.17 mg 葡萄糖-纈氨酸混合物，分別進行熱解以及在線GC/MS 分析。熱解條件：

2 結果與討論

2.1 纈氨酸與卷煙主流煙氣成分的定性關系

為確定13C5-15N-纈氨酸對卷煙主流煙氣貢獻的化學成分，按照不同質荷比逐個疊加對照樣和13C5-15N-纈氨酸添加的實驗樣色譜圖，疊加離子質量數范圍為30～200 amu，記錄實驗樣與對照樣相比有增加的離子，并記錄對應的保留時間。根據對照樣對應的保留時間質譜圖，采用NIST14 譜庫定性對應化合物。以2-甲基丙醛為例，對纈氨酸相關煙氣成分的定性進行方法描述。選擇實驗樣和對照樣的色譜圖，疊加每個質荷比選擇離子色譜圖（圖1）。在保留時間14.4 min 處發現，與對照樣相比，實驗樣m/z=76、46、44、29 等離子的豐度大幅增加。表明保留時間14.4 min 處的化合物與13C5-15N-纈氨酸相關。

圖1 實驗樣（添加有13C5-15N-纈氨酸）與對照樣在14.4 min 處疊加色譜圖Fig.1 Overlaying chromatogram of experimental samples(spiked by 13C5-15N-valine)and the control at retention time of 14.4 min

圖2a 為對照樣14.4 min 處色譜峰的質譜圖，以NIST14 譜庫定性，表明該化合物為2-甲基丙醛。比較對照樣和實驗樣保留時間14.4 min 處對應成分的質譜圖（圖2）可以發現，實驗樣質譜圖中m/z=76、46、44、29 的相對豐度大幅增加。2-甲基丙醛的分子離子峰為m/z=72，主要碎片離子m/z=43、41 和27，分別對應于［M-HCO］+、［M-CH3O］+和［C2H5］+；實驗樣中m/z=76（72+4）、46（43+3）、44（41+3）和29（27+2）分別對應于這4 個離子的同位素標記離子。因此可以推測，實驗樣卷煙主流煙氣中增加的2-甲基丙醛為13C4標記，4 個碳原子均來自纈氨酸分子。

圖2 對照樣（a）和實驗樣（b）主流煙氣2-甲基丙醛的質譜圖Fig.2 Mass spectra of 2-methylpropanal in mainstream smoke of the control(a)and experimental(b)samples

圖3 是對照樣和實驗樣主流煙氣中甲基吡嗪（C5H6N2）的質譜圖。對照樣中甲基吡嗪的分子離子峰為m/z=94，m/z=95 對應于天然同位素的分子離子峰。實驗樣中m/z=95 的相對豐度明顯增加；同時m/z=68 相對m/z=67 略有增加。表明實驗樣卷煙主流煙氣中增加了同位素標記的甲基吡嗪。

圖3 對照樣（a）和實驗樣（b）主流煙氣中甲基吡嗪的質譜圖Fig.3 Mass spectra of methylpyrazine in mainstream smoke of the control(a)and experimental(b)samples

圖4 是對照樣和實驗樣2-環戊烯-1-酮（C5H6O）的質譜圖。對照樣顯示2-環戊烯-1-酮的分子離子峰為m/z=82。實驗樣中m/z=85 的離子相對豐度顯著增加，對應于M+3 的同位素分子離子峰。對應地，實驗樣中m/z=84、55 等離子均比對照樣略有增加。由此可以推測，實驗樣卷煙主流煙氣中增加了2-環戊烯-1-酮，且只有3 個碳原子來自纈氨酸。

圖4 對照樣（a）和實驗樣（b）主流煙氣中2-環戊烯-1-酮的質譜圖Fig.4 Mass spectra of 2-cyclopenten-1-one in mainstream smoke of the control(a)and experimental(b)samples

除了2-甲基丙醛、甲基吡嗪、2-環戊烯-1-酮外，還發現實驗樣煙氣中增加了全13C 標記的3-甲基丁酸、異丁烷和2-甲基-1-丙烯等，表明纈氨酸對煙氣中這3 種化合物的形成有一定貢獻。這6 種化合物的分子式、主要質譜離子和13C5-15N 標記纈氨酸實驗樣質譜圖中主要增加的離子見表1。

需要說明的是，纈氨酸在卷煙燃吸時熱解、燃燒可能形成的CO、CO2、氨、氰化氫等小分子成分在本分析方法中均無法覆蓋。

2.2 纈氨酸與卷煙主流煙氣成分的量效關系

為了確定纈氨酸與上述6 種化合物的量效關系，分別選擇非標記和同位素標記化合物定量離子，以非標記定量離子峰面積與內標峰面積比值定量對照樣中各化合物的釋放量；以同位素標記定量離子峰面積與內標峰面積比值的增量定量實驗樣中同位素標記化合物的釋放量。依據添加實驗結果可估算煙絲中纈氨酸對煙氣化合物的貢獻率（%）：

表1 與纈氨酸相關的卷煙煙氣化學成分Tab.1 Contribution of valine to cigarette smoke components

R=［(Y/A)×C0］/Y0

式中：Y 為實驗樣同位素標記化合物釋放量，μg/支；A 為氨基酸添加量，μg/g；C0為煙絲中氨基酸質量分數，μg/g；Y0為對照樣化合物釋放量，μg/支。

纈氨酸對6 種化合物的估算貢獻率結果見表2，表2 中實驗樣化合物釋放量為同位素標記化合物的釋放量。纈氨酸對煙氣2-甲基丙醛的貢獻率最大，達69%；對3-甲基丁酸、甲基吡嗪、異丁烷、2-甲基-1-丙烯、2-環戊烯-1-酮的貢獻率均小于5%。

表2 纈氨酸對卷煙主流煙氣中6 種化合物的估算貢獻率Tab.2 Estimated contribution rates of valine to 6 compounds in mainstream cigarette smoke

2.3 形成機制

分別對纈氨酸、葡萄糖和纈氨酸-葡萄糖混合物（摩爾比約為1∶1）進行熱解，初步探討纈氨酸促進煙氣6 種成分形成的機制，結果見表3。纈氨酸熱解產物中檢測到2-甲基丙醛和2-甲基-1-丙烯，葡萄糖熱解產物中6 種化合物均沒有檢出，纈氨酸/葡萄糖混合物中檢出2-甲基丙醛、甲基吡嗪、異丁烷和2-甲基-1-丙烯。2-甲基丙醛在纈氨酸熱解產物中歸一化面積達22.12%，為纈氨酸的主要熱解產物，而且在纈氨酸-葡萄糖混合物的熱解產物中2-甲基丙醛峰面積和歸一化面積均顯著增加，表明葡萄糖的存在促進了纈氨酸熱解形成2-甲基丙醛。

纈氨酸單獨熱解可以通過分子內脫氨、脫CO形成2-甲基丙醛［18］，如圖5 所示。在葡萄糖存在下，纈氨酸可通過Strecker 降解反應形成2-甲基丙醛［19］，即纈氨酸與Maillard 初級反應產物α-二酮反應形成Schiff 堿，然后經重排、脫羧和水解產生比纈氨酸少一個碳原子的2-甲基丙醛，如圖6所示。纈氨酸添加至卷煙中，經燃燒產生2-甲基丙醛應該是兩種機制共同作用。氨基酸與糖熱解相互作用形成了甲基吡嗪、異丁烷。在熱解產物中并沒有檢測到3-甲基丁酸和2-環戊烯-1-酮，表明這兩種化合物的形成可能與煙草其他基質成分相關。

表3 纈氨酸、葡萄糖及其混合物熱解產物中6 種化合物的峰面積Tab.3 Peak areas of 6 compounds in pyrolysates of valine,glucose,and their mixture

圖5 纈氨酸直接熱解形成2-甲基丙醛的機理[18]Fig.5 Mechanism of formation of 2-methylpropanal from pyrolysis of valine

圖6 葡萄糖促進纈氨酸熱解產生2-甲基丙醛的機理[19]Fig.6 Mechanism of formation of 2-methylpropanal from pyrolysis of valine in the presence of glucose

2.4 感官作用

以對照卷煙為空白，分別添加約50、100、200、300、500 μg/g 纈氨酸進行感官評價。結果顯示，添加50 μg/g 的纈氨酸對煙氣感官沒有明顯影響；隨著纈氨酸添加量增加，煙氣中堅果香和烤煙香韻增加，煙氣濃度增加。500 μg/g 添加量的煙氣過濃、刺激明顯。對于該煙絲來說，適宜的添加量應該在100～300 μg/g 之間。2-甲基丙醛具有甜的、巧克力味，可增加煙氣豐滿度；纈氨酸具有甜的、堅果香、烤煙香韻［20］，兩者對卷煙香氣的影響基本一致。結合量效關系研究可以推斷，煙草中纈氨酸對煙氣香氣的貢獻主要來自煙氣2-甲基丙醛釋放量的增加。2-甲基丙醛也被用作煙草添加劑［16］，但其沸點僅為64 ℃，在使用過程中容易散失，因此，可以采用不揮發的纈氨酸替代2-甲基丙醛作為煙草添加劑。

3 結論

卷煙添加穩定同位素標記纈氨酸研究纈氨酸與相關主流煙氣成分的定性關系和量效關系的結果表明：①纈氨酸與煙氣中2-甲基丙醛、異丁烷、甲基吡嗪、3-甲基丁酸、2-環戊烯-1-酮和2-甲基-1-丙烯等化合物的形成有關。②纈氨酸對2-甲基丙醛的貢獻率最大，達69%，對異丁烷、甲基吡嗪、3-甲基丁酸、2-環戊烯-1-酮、2-甲基-1-丙烯的貢獻率均小于5%。③纈氨酸對煙氣香氣的影響主要來自纈氨酸自身熱解和Strecker 降解產生的2-甲基丙醛。