溫度對(duì)以楓槭葉為原料的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的分布及卷煙加香的影響

許春平，曲利利，白家峰，農(nóng)李政，陳義昌，許靄飛，馬擴(kuò)彥，劉紹華*

1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)科學(xué)大道166 號(hào) 450001

2.廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，南寧市北湖南路28 號(hào) 530001

3.重慶中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)研發(fā)中心，重慶市南岸區(qū)南坪東路2 號(hào) 400060

近年來，利用微生物發(fā)酵技術(shù)［1］、酶解技術(shù)［2-3］、美 拉德反應(yīng)［4-5］等由天然產(chǎn)物的提取物制備煙用香料的報(bào)道較多，利用這些技術(shù)不但可以改善煙氣的品質(zhì)，還可以提高原料的利用率。利用酶解技術(shù)結(jié)合美拉德反應(yīng)制備煙用香料的研究也有報(bào)道。馬海昌［6］以煙梗為原料，通過外加酶法制備煙梗的水提取液，采用微生物發(fā)酵產(chǎn)香結(jié)合美拉德反應(yīng)生產(chǎn)煙用香料，產(chǎn)出的香料能夠豐富卷煙香味，減輕不利氣味。胡希等［7］以新鮮的紅心獼猴桃為原料，利用果膠酶、糖化酶和纖維素酶對(duì)其進(jìn)行降解，然后通過自身的美拉德反應(yīng)制成香料，不僅能夠豐富雪茄煙的風(fēng)格，而且可以使雪茄煙吃味甘甜、舒適，煙氣醇和柔和。駱莉等［8］采用外源活性酶對(duì)煙梗進(jìn)行處理，利用微生物發(fā)酵結(jié)合美拉德反應(yīng)技術(shù)，不僅能增加煙梗提取液風(fēng)味物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，還能改善煙梗提取液品質(zhì)。徐若飛等［9］以天然香菇為原料，采用酶解法和美拉德反應(yīng)結(jié)合技術(shù)開發(fā)新型煙用香料，產(chǎn)出的香料可以增加煙香，柔和煙氣，增加細(xì)膩性和甜潤感。王吉中等［10］以槐花為原料，采用酶解法和美拉德反應(yīng)法制備槐花香料，所得揮發(fā)性香味物質(zhì)種類比用水直接提取法和單獨(dú)酶解法多。

楓槭浸膏是一種傳統(tǒng)的食品用天然香料（在《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中的編碼為N062）［11］和煙用香料，在食品和卷煙行業(yè)應(yīng)用廣泛。楓槭浸膏是楓槭葉粉末經(jīng)乙醇提取、濃縮后得到的提取物，楓槭浸膏在卷煙中應(yīng)用時(shí)可賦予卷煙焦甜香、烘烤香等香韻。蘇東贏［12］采用裂解-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Py-GC-MS）技術(shù)模擬卷煙燃燒過程，將楓槭浸膏在不同溫度下進(jìn)行熱裂解，對(duì)裂解產(chǎn)物進(jìn)行定性、定量分析，并進(jìn)行卷煙加香實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)楓槭浸膏在煙絲中的添加量為0.02%時(shí)可突出焦甜香韻和改善卷煙的抽吸品質(zhì)。蔡莉莉等［13］分析了5種市售楓槭浸膏的揮發(fā)性成分，并采用單因素方差分析和主成分分析法比較了其揮發(fā)性成分的差異。前人的研究主要集中在市售楓槭浸膏的化學(xué)成分分析，未見楓槭葉美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的相關(guān)研究報(bào)道。本研究中以楓槭葉為原料，通過復(fù)合酶酶解將楓槭葉粉末中的蛋白質(zhì)和多糖轉(zhuǎn)化為氨基酸和還原糖，然后對(duì)楓槭葉粉末酶解液進(jìn)行不同溫度（70、80、90、100、110 ℃）下的美拉德反應(yīng)，采用GC-MS 聯(lián)用技術(shù)對(duì)楓槭葉粉末酶解液的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定性分析和主成分分析，將制備的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)用到煙絲上并進(jìn)行加香評(píng)吸，考察其加香效果，旨在為煙用天然香料的開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

楓槭葉（廣東梅州2017 年產(chǎn)）；空白煙（廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司）。

纖維素酶（酶活50 000 U/g）、果膠酶（酶活100 000 U/g）、半纖維素酶（酶活200 000 U/g）（江蘇銳陽生物科技有限公司）；木瓜蛋白酶（酶活600 000 U/g）（北京索萊寶科技有限公司）；1,2-丙二醇、1 moL/L H2SO4、二氯甲烷、無水乙醇（AR，天津市富宇化工有限公司）；1.245 mg/mL 乙酸苯乙酯（色譜純，美國Sigma-Aldrich 公司）。

Q-100A3 高速多功能粉碎機(jī)（上海冰都電器有限公司）；RLGOL Ultra-3400 紫外分光光度計(jì)［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；DGX-9143 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海福瑪設(shè)備有限公司）；TGL-16M 離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；同時(shí)蒸餾萃取裝置（鄭州科技玻璃儀器廠）；GC6890-MS5973N 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent 科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 預(yù)處理

稱取200 g楓槭葉，置于60 ℃烘箱中烘烤10 min，自然冷卻至室溫；粉碎過孔徑25 μm（300 目）篩，楓槭葉粉末裝于密封袋后置冰箱中保存。

1.2.2 樣品酶解處理

取楓槭葉粉末，平均分成若干份，每份質(zhì)量為15.0 g，每份均以料液比1∶10（質(zhì)量∶體積，g/mL）的比例加150 mL 水。

加酶量對(duì)氨基酸和還原糖的影響：酶解時(shí)間5 h，酶解溫度50 ℃，pH 為5，酶解加酶量分別為底物的1.0%、1.5%、2.0%、2.5%（4 種酶分別為纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶，4 種酶的添加比例為1∶1∶1∶1）。

pH 對(duì)氨基酸和還原糖的影響：酶解時(shí)間5 h、酶解溫度50 ℃，酶解加酶量為底物的1.5%，酶解液pH 分別為5、6、7、8。

酶解時(shí)間對(duì)氨基酸和還原糖的影響：酶解溫度50 ℃，酶解的加酶量為底物的1.5%，酶解液pH為5，酶解時(shí)間分別是4、5、6、7 h。

1.2.3 還原糖和氨基酸的測定

采用DNS 法測定水溶性還原糖［14］，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，在520 nm 波長處測定8 個(gè)樣品的還原糖吸光度，計(jì)算得到其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

采用茚三酮法測定水溶性氨基酸［15］，以氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，在570 nm波長處測定6 個(gè)樣品的氨基酸吸光度，計(jì)算得到其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線及稀釋倍數(shù)按公式（1）計(jì)算氨基酸或還原糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（mg/g）：

式中：m—氨基酸或還原糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/g；V—氨基酸或還原糖的體積，mL；c—氨基酸或還原糖的濃度，mg/mL；n—稀釋倍數(shù)；m0—樣品質(zhì)量，g。

1.2.4 以楓槭葉粉末為原料進(jìn)行美拉德反應(yīng)

將30%的氫氧化鈉溶液分別加到150 mL 未加酶的和加酶的楓槭葉粉末溶液中，調(diào)節(jié)體系pH 為7，然后分別置于70、80、90、100、110 ℃烘箱中反應(yīng)3 h［16-17］，得到不同的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。

1.2.5 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物香味成分分析［18-21］

在同時(shí)蒸餾萃取裝置的平底燒瓶中加入美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，再加入100 mL 蒸餾水，搖勻，在電子調(diào)溫電熱套中加熱，在裝置的另一端蒸餾瓶中加50 mL二氯甲烷，在60 ℃水浴鍋中加熱。當(dāng)二氯甲烷與水出現(xiàn)分層時(shí)開始計(jì)時(shí)，2.5 h 后萃取結(jié)束，待冷卻后，在二氯甲烷萃取液中加入10 g無水硫酸鈉和1 mL 濃度為1.245 mg/mL 的乙酸苯乙酯，靜置過夜。在35～40 ℃的水浴鍋中濃縮至1 mL，用0.45 μm有機(jī)相微孔濾膜過濾，以乙酸苯乙酯為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行GC/MS 分析，采用峰面積歸一化法測量美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)［22］。GC/MS條件：

色譜柱：HP-5MS 色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；載氣：氦氣；載氣流速：3 mL/min；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；分流比：10∶1；進(jìn)樣量：1 μL；升溫程序：50 ℃280 ℃；離子源：EI 源；接口溫度：270 ℃；電子能量：70 eV；四極桿溫度：150 ℃；采集模式：掃描；質(zhì)量掃描范圍：35～550 amu；檢索譜庫：NIST11 庫。

1.2.6 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物卷煙加香感官評(píng)價(jià)

將不同溫度美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在體系壓力95 kPa、水浴50 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到楓槭浸膏樣品，用95%乙醇將其稀釋成2%（質(zhì)量比）的溶液。分別取20 g 空白煙煙絲，按照0.02%（樣品占煙絲質(zhì)量比）稱取配好的楓槭浸膏乙醇溶液，用噴霧器均勻噴灑在葉絲上，手工卷制。在溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度（60±5）%的恒溫恒濕箱中平衡24 h 后進(jìn)行評(píng)吸。取空白煙加等量乙醇后作對(duì)照。由具有廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司評(píng)吸員資質(zhì)的8 名技術(shù)人員從香氣質(zhì)、協(xié)調(diào)性、刺激性、雜氣等方面進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與討論

2.1 以氨基酸和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)優(yōu)化酶解條件

在美拉德反應(yīng)中，氨基酸和還原糖的種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)均會(huì)對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物有影響。游霞等［23］以煙草廢棄物為原料，以還原糖得率為酶反應(yīng)衡量指標(biāo)，確定用酶法制備美拉德反應(yīng)香料；錢敏等［24］研究表明參與反應(yīng)的氨基酸種類越多，產(chǎn)物中揮發(fā)性物質(zhì)的種數(shù)也越多，反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味越豐富；符笳茵等［25］研究表明在美拉德反應(yīng)過程中，氨基酸的增量和還原糖的消耗量均與美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的量顯著正相關(guān)。因此，以氨基酸和還原糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為酶反應(yīng)的衡量指標(biāo)。還原糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.053 7x+0.123 6，R2=0.993 5；氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.192 1x-0.152 1，R2=0.992 8。由圖1～圖3 可知，當(dāng)加酶量為1.5%（圖1）、pH 為7（圖2）、酶解時(shí)間為5 h（圖3）時(shí)，氨基酸和還原糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大，說明酶解最優(yōu)加酶量為1.5%，最優(yōu)pH 為7，最優(yōu)時(shí)間為5 h。其中酶解6 h 與5 h 相比，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低（圖3），這可能是酶解時(shí)間延長后酶解液中還原糖濃度較高，導(dǎo)致還原糖“回吸”的緣故［26］。

圖1 加酶量對(duì)氨基酸和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.1 Effect of enzyme application rate on contents of amino acid and reducing sugar

圖2 pH 對(duì)氨基酸和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.2 Effect of pH on contents of amino acid and reducing sugar

圖3 酶解時(shí)間對(duì)氨基酸和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on contents of amino acid and reducing sugar

2.2 不同溫度下楓槭葉粉末酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的GC-MS 分析

對(duì)楓槭葉粉末酶解液在不同溫度（70、80、90、100、110 ℃）下美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的揮發(fā)性成分進(jìn)行GC-MS 分析。由表1 可知：已鑒定出的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物主要包括酸類、醇類、酯類、酚類、醛類、酮類、烯烴類、烷烴類、酰胺、呋喃類、吡啶類等成分。這些物質(zhì)的匹配度均大于80%，通常匹配度大于80%的鑒定結(jié)果較為可信［27］，已鑒定出的揮發(fā)性成分種類由多到少依次為美拉德反應(yīng)溫度90、100、110、80、70 ℃，分別有69、59、49、27、21種成分；揮發(fā)性成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由多到少對(duì)應(yīng)的美拉德反應(yīng)溫度依次為90、100、110、80、70 ℃，即當(dāng)美拉德反應(yīng)溫度為90 ℃時(shí)，鑒定出的揮發(fā)性成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大。

表1 不同溫度下楓槭葉粉末酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tab.1 Contents of volatile components in Maillard reaction products of enzymatic hydrolysate from maple leaf powder at different temperatures (μg·g-1)

表1 （續(xù)）

表1 （續(xù)）

由圖4 和圖5 可以看出，未酶解與酶解后的楓槭葉粉末美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和揮發(fā)性成分種類在70、80、90、100、110 ℃的變化趨勢基本一致，均是在90 ℃時(shí)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，揮發(fā)性成分種類較多；酶解后的楓槭葉粉末美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的揮發(fā)性成分總量和種類均顯著增加。

圖4 未酶解和酶解后楓槭葉美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨溫度的變化Fig.4 Variation of volatile component contents in Maillard reaction products from maple leaves without/with enzymatic hydrolysis along with temperature

圖5 未酶解和酶解后楓槭葉美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性成分種類隨溫度的變化Fig.5 Variation of volatile component kinds in Maillard reaction products from maple leaves without/with enzymatic hydrolysis along with temperature

2.3 楓槭葉粉末酶解液經(jīng)不同溫度反應(yīng)后美拉德反應(yīng)特征揮發(fā)性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢

吡嗪類化合物普遍帶有堅(jiān)果香、烘烤香、甜香，是美拉德反應(yīng)的重要產(chǎn)物，其閾值較低，對(duì)揮發(fā)性香味貢獻(xiàn)較大［28-29］。四甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與美拉德反應(yīng)產(chǎn)物總量的變化趨勢基本一致，可以用這2 種吡嗪類化合物作為該反應(yīng)過程的標(biāo)志性物質(zhì)。因此分別以5 個(gè)美拉德反應(yīng)溫度梯度為橫坐標(biāo)，以兩種美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，即四甲基吡嗪和2,3-二甲基吡嗪的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、美拉德反應(yīng)產(chǎn)物總量為縱坐標(biāo)作圖（圖6）。

圖6 美拉德反應(yīng)特征香味成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)和反應(yīng)產(chǎn)物總量隨溫度的變化Fig.6 Variations of characteristic aroma component contents and the total amount of Maillard reaction products along with temperature

由圖6 可知，隨著溫度的升高，四甲基吡嗪和2,3-二甲基吡嗪從無到有，90 ℃時(shí)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最高，在100 ℃和110 ℃時(shí)質(zhì)量分?jǐn)?shù)又有所下降。研究表明形成吡嗪的機(jī)理是α-二羰基化合物和胺通過Strecker 降解發(fā)生相互作用［30-31］，Strecker降解反應(yīng)的發(fā)生需要相對(duì)較高的反應(yīng)溫度和小分子的苯甲醛存在［32］。由表1 可知，在低溫（70、80 ℃）時(shí)沒有苯甲醛生成，因此也沒有2,3-二甲基吡嗪、四甲基吡嗪生成；在90 ℃時(shí)檢測到苯甲醛，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)較大，為2.0 μg/g，此溫度下吡嗪的量也達(dá)到最高；在100 ℃和110 ℃時(shí)檢測到苯甲醛的量逐步降低，這可能抑制了吡嗪的生成，導(dǎo)致吡嗪的量又有所下降［33］。因此，溫度對(duì)吡嗪類化合物形成的影響顯著。

2.4 楓槭葉粉末酶解液經(jīng)不同溫度反應(yīng)后美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的物理外觀

楓槭葉粉末酶解液經(jīng)不同溫度反應(yīng)后美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的物理外觀結(jié)果見表2。結(jié)果表明：楓槭葉粉末酶解液在90 ℃時(shí)的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物物理外觀較好，呈深褐色，比較黏稠，香味方面焦糖香和甜香突出。

2.5 加香效果

不同溫度美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在卷煙加香后的評(píng)吸結(jié)果見表3。結(jié)果表明：楓槭葉粉末酶解液在90 ℃時(shí)的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)用于卷煙后，可提升卷煙煙氣的香氣質(zhì)，改善雜氣和刺激性，余味更舒適，加香效果更好。該研究結(jié)果與90 ℃是制備楓槭葉粉末酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物最佳溫度的結(jié)論相一致。

表2 不同溫度楓槭葉美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的物理外觀和特征香氣Tab.2 Physical appearance and characteristic aroma of Maillard reaction products from maple leaves at different temperatures

表3 不同溫度楓槭葉美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的卷煙加香評(píng)吸結(jié)果Tab.3 Results of sensory evaluation of cigarettes containing Maillard reaction products from maple leaves obtained at different temperatures

3 結(jié)論

①楓槭葉粉末酶解液經(jīng)不同溫度的美拉德反應(yīng)，產(chǎn)物的種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化較大，主要包括醇類、酸類、酯類、醛類、酮類、烯烴類、呋喃類、吡嗪類化合物等成分。70、80、90、100、110 ℃下美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的種類分別為21、27、69、59、49 種，揮發(fā)性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別32.19、118.6、252.0、194.1、178.5 μg/g；反應(yīng)溫度為90 ℃時(shí)，楓槭葉粉末酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性成分的種類最多，揮發(fā)性成分總量最高。②楓槭葉粉末酶解液在90 ℃時(shí)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的特征香味成分（四甲基吡嗪和2,3-二甲基吡嗪）質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。③楓槭葉粉末酶解液在90 ℃時(shí)的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)用于卷煙后，可提升卷煙煙氣的香氣質(zhì)，改善雜氣和刺激性，余味更舒適。該結(jié)果與90 ℃是制備楓槭葉粉末酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物最佳溫度的結(jié)論一致。