5-羥色胺轉運體基因多態性與AEOPD短期激素干預療效的關系

胡斯明 徐曉

蘇州市立醫院呼吸科215000

COPD為臨床常見多發慢性呼吸系統疾病，流行病學調查發現近幾年其患病率呈上升趨勢，中老年人為多發群體，病程較長，病情呈進行性發展，目前發病機制尚未完全清楚[1]。而目前臨床上COPD急性加重期(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD)治療包括糖皮質激素、抗生素、呼吸興奮劑等，其中糖皮質激素應用較為廣泛，可影響多種信號轉導與基因表達路徑，誘導AECOPD患者體內多種炎癥介質水平下降，減輕氣道重塑，改善肺功能，降低短期內復發[2]。有報道稱藥物代謝酶、轉運體及藥物作用受體的基因多態性與藥物治療個體差異性有關，其中5-羥色胺轉運體(5-serotonin transporter，5-HTT)作為一種跨膜轉運蛋白，5-羥色胺轉運體基因啟動子區多態性(5-serotonintransporter-linked promoter region，5-HTTLPR)與5-羥色胺轉運體第二內含子多態性(5-serotonin transporter gene 2 VNTR polymorphism，5-HTTVNTR)影響SERT轉錄活性，可能使不同基因型個體對同一種抗AECOPD藥的療效不同，故對SERT的合成進行編碼控制的基因成為研究AECOPD的重要候選基因[3]。目前，關于SERT基因多態性與AECOPD相關性的研究結果不盡相同，而短期激素干預療效與其關系的研究尚未見報道[4]。因此，本文主要探究SERT基因多態性與AECOPD短期激素干預療效的關系，報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 采用隨機平行對照方法納入2017年1月至2018年1月于蘇州市立醫院呼吸科收治的68例AECOPD患者為研究對象，開展前瞻性研究，本研究獲我院醫學倫理委員會批準。納入標準： (1)符合《慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)診治中國專家共識(2014年修訂版)》[5]中相關診斷標準，均經胸部CT、X線胸片及肺功能等檢查確診為AECOPD，無肺動脈高壓；(2)年齡≥42歲，均處于急性加重期；(3)對本研究知情且簽署知情同意書。排除標準：(1)合并嚴重肝腎功能損傷、癌癥、腸易激惹綜合征、血小板數量或功能異常者；(2)伴肺部器質性病變，如肺結核、支氣管哮喘、肺炎等；(3)入選前1個月服用過內皮素受體拮抗劑(波生坦等)、磷酸二酯酶-5抑制劑(西地那非等)或5-HT相關藥物；(4)存在精神系統疾病，如躁狂癥、抑郁癥、孤獨癥、精神分裂等；(5)存在糖皮激素使用禁忌證者。68例患者中，男46例，女22例，年齡(62.32±5.21)歲，年齡范圍為42～74歲。研究符合《赫爾辛基宣言》的原則。

1.2 研究方法

1.2.1 治療方法 所有患者均接受常規基礎治療，包括呼吸機鍛煉、吸氧、化痰、平喘、抗感染、擴張支氣管、糾正酸堿失衡、維持水電解質平衡等。在此基礎上所有患者吸入布地奈德福莫特羅粉吸入劑[英國阿斯利康制藥有限公司，國藥準字H20140458，規格(160μg+4.5μg)/吸]，2次/d，2吸/次，持續3個月。所有受試對象在治療期內不再使用任何其他糖皮質激素。

1.2.2 檢測方法

1.2.2.1 儀器與試劑 儀器包括Alphalmager HP凝膠成像分析系統(Alpha Innotech corp.USA)、聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)基因擴增儀2720(美國ABI公司)、TGL-16G臺式低溫高速離心機(中國上海安亭科學儀器廠)，其他儀器如MDF-382E超低溫冰箱、Denver TB-203精密電子天平等均購自中國北京賽多利斯儀器系統有限公司。PCR試劑盒由中國上海生工生物技術服務有限公司生產；DNA快速提取試劑盒由中國天根生化科技(北京)有限公司生產；實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒由中國上海吉瑪制藥技術有限公司生產；SERT特異性引物序列由中國生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2.2 5-HTT基因多態性檢測方法 采集患者外周靜脈血3 ml，乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝，應用全血基因組DNA提取試劑盒(購自中國北京索萊寶科技公司)提取基因組DNA，設計5-HTTLPR引物序列(表1)，行PCR反應。PCR反應條件：94℃5 min預變性，繼以94℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸1 min，共持續35個循環，并以72℃修復延伸7 min后降落至4℃，置入4℃冰箱保存待測。同時，設計5-HTTVNTR引物序列(表1)，行PCR反應。PCR反應條件：94℃5 min預變性，繼以94℃變性45 s，60℃退火40 s，72℃延伸45 s，共35個循環，最后72℃修復延伸7 min，置入4℃冰箱保存待測。產物經PCR反應后采用瓊脂糖凝膠電泳方法，以3%瓊脂糖凝膠、80 V電壓電泳40 min，溴乙錠染色后將凝膠電泳圖像輸入Alphalmager HP凝膠成像分析系統進行分析，鑒定基因型結果。5-HTTLPR基因包括L型(528 bp)、S型(484 bp)。按照條帶不同位置，劃分為3種類型，即純合子S/S型、L/L型和雜合子S/L型。5-HTTVNTR基因型包括3種，即10/12、10/10、12/12；存在2個等位基因，即Stin2.10(267 bp)、Stin2.12(301 bp)。

表1 PCR引物設計

1.2.2.3 5-HTT基因表達檢測方法 依據RTPCR試劑盒要求，全血提取5-HTT RNA基因、逆轉錄與PCR擴增。以相對定量方法對比內參樣品與樣品轉錄間表達。計算公式：△△Ct=AVERAGE(樣本Ct值)-AVERAGE(內參Ct值)。

1.3 觀察指標 (1)統計患者基線資料，包括性別、年齡、病程、體質量指數(body mass index，BMI)、體溫、血糖、白細胞計數等；(2)觀察短期激素干預療效，按照激素干預療效，將患者劃分為疾病控制組、疾病未控制組。激素干預療效判定如下。參考相關標準[6]，治愈：咳嗽、咳痰、氣促等臨床癥狀完全消失，未出現日間及夜間癥狀，胸部CT或X線胸片異常影像減少，肺部病變消失，慢性阻塞性肺疾病評估測試(chronic obstructive pulmonary disease assessment test，CAT)評分、第1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in the first second，FEV1)基本恢復正常(CAT與治療前比較降低＞70%，FEV1%pred較治療前增加＞70%)；顯效：臨床癥狀基本消失，影像學檢查肺部病變減少，肺功能基本正常，CAT評分、FEV1顯著改善(CAT與治療前比較降低50%～70%，FEV1%pred較治療前增加≥50%但＜70%)；有效：臨床癥狀有不同程度減輕，肺部病變明顯減少，肺功能好轉，CAT評分、FEV1改善(CAT與治療前比較降低30%～49%，FEV1%pred較治療前增加≥30%但＜50%)；無效：上述臨床癥狀及體征均未達標，或加重。其中，治愈、顯效、有效均歸入疾病控制組，其余納入疾病未控制組。

1.4 統計學分析 采用SPSS 19.0軟件處理上述數據，以百分率(%)表示計數資料，組間行χ2檢驗；以±s表示計量資料，組間行t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者短期療效分析 68例AECOPD患者均接受為期3個月的激素治療后治愈31例，占45.59%；顯效20例，占29.41%；有效8例，占11.76%，均歸入疾病控制組。無效9例，占13.24%，歸入疾病未控制組。

2.2 疾病控制組與疾病未控制組基線資料對比 2組性別、年齡、病程、BMI等基線資料比較差異無統計學意義(P值均＞0.05)，見表2。

2.3 2 組5 -HTTLPR基因型及頻率分布 2組患者5-HTTLPR基因型、等位基因頻率均符合Hard-Weinberg平衡定律，樣本具有群體代表性。疾病控制組S/S基因型頻率與S等位基因頻率顯著高于疾病未控制組(χ2=3.989、5.165，P值均＜0.05)，L等位基因頻率顯著低于疾病未控制組(χ2=5.165，P=0.023)，見表3。

2.4 2 組5 -HTTVNTR基因型及頻率分布 2組患者5-HTTVNTR基因型、等位基因頻率均符合Hard-Weinberg平衡定律，樣本具有群體代表性。疾病控制組10/10、12/10、12/12基因型頻率與10、12等位基因頻率較疾病未控制組差異無統計學意 義(χ2=0.149、0.004、0.512、0.007、0.007，P值均＞0.05)，見表4。

表2 疾病控制組與疾病未控制組基線資料對比

表3 2組5-HTTLPR基因型及頻率分布[例(%)]

表4 2組5-HTTVNTR基因型及頻率分布[例(%)]

2.5 2 組5 -HTTLPR、5-HTTVNTR基因表達水平比較 疾病控制組5-HTTLPR m RNA表達顯著低于疾病未控制組(t=2.249，P=0.027)，5-HTTVNTR m RNA表達較疾病未控制組差異無統計學意義(t=1.835，P=0.071)，見表5。

表5 2組5-HTTLPR、5-HTTVNTR基因表達水平比較(±s)

表5 2組5-HTTLPR、5-HTTVNTR基因表達水平比較(±s)

注：5-HTTLPR為5-羥色胺轉運體基因啟動子區多態性；5-HTTVNTR為5-羥色胺轉運體基因第二內含子多態性

組別 例數5-HTTLPR mRNA 5-HTTVNTR mRNA疾病控制組 59 0.000 18±0.000 17 0.000 17±0.000 13疾病未控制組 9 0.000 32±0.000 20 0.000 26±0.000 18 t值 2.249 1.835 P值 0.027 0.071

3 討論

5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)屬于一種血管活性物質，有報道稱其與肺部炎癥反應及肺動脈高壓的形成有關[7]。動物實驗發現，使用5-HT再攝取抑制劑可降低AECOPD大鼠肺動脈壓，抑制肺組織炎癥反應[8]。馮喜英和陳婧[9]表明AECOPD患者血小板會大量釋放存貯的5-HT，引起血小板內5-HT濃度下降，其降低幅度與肺動脈高壓嚴重程度有關。所以，目前諸多學者認為5-HT在AECOPD發生發展中占據著重要作用[10-11]。5-HT經與肺血管平滑肌細胞上的5-HTT轉運，引起血管平滑肌細胞增殖。而5-HTT基因位于染色體17q11.1～12區域，長35 kb，存在14個內含子、2個常見多態性(5-HTTLPR、5-HTTVNTR)，能誘導效應部位過多聚集的5-HT再攝取，終止5-HT作用，幫助合成新的5-HT提供底物[12]。近年來，有研究發現5-HTT基因多態性與腸易激惹綜合征、精神系統疾病(如孤獨癥、抑郁癥等)、呼吸系統疾病(如肺動脈高壓、AECOPD等)等有關，但國內關于5-HTT基因多態性與AECOPD的相關性報道較少，尤其是其與AECOPD短期激素干預療效之間的關系未見報道[13]。因此，筆者對此進行了探討。

本研究結果顯示，疾病控制組5-HTTVNTR基因型及頻率分布較疾病未控制組差異無統計學意義，但S/S基因型頻率明顯高于疾病未控制組，提示擁有S/S基因型的AECOPD患者短期激素干預療效較好。但有研究表示，“S”等位基因與藥物起效慢、療效差相關，而“L”等位基因與藥物起效快、療效好密切相關[14]。朱曉昱等[15]表示，與具有“S”等位基因的單相抑郁患者比較，具有“L”等位基因的單相抑郁患者對安慰劑和氟西汀的療效均較好。Yang等[16]認為具有“L”基因型的單相抑郁患者服用氟西汀4周后療效較好。但國外諸多國家(如韓國、日本等)的研究結果與上述結果相反。Santangelo等[17]發現“S/S”基因型患者對氟西汀及帕羅西汀療效較好。Miller等[18]發現5-HTTVNTR多態性與氟伏沙明療效無明顯關聯。而本文發現，5-HTT基因多態性影響AECOPD短期激素干預療效，主要表現為S/S基因型療效均優于L/L基因型。筆者推測，具有S/S基因型的AECOPD患者5-HTT蛋白呈低表達，5-HT大量堆積，促使5-HT4受體出現適應性下調或去敏感現象，這可能與藥物療效相關；而激素干預后，與5-HT4受體結合，促使受體狀態與敏感性改變，導致堆積在效應部位的5-HT能發揮效能；而L/L基因型高表達5-HTT蛋白，導致血小板大量釋放存貯的5-HT，促進AECOPD形成，促使效應部位5-HT被超前攝取，減少了5-HT與5-HT4受體及5-HT1P受體的結合，誘導5-HT受體適應性上調，或其敏感性增加，很大程度上降低了激素干預療效。動物實驗表現，盡管糖皮激素能高效結合5-HT4受體，但L/L基因型的高表達可能會部分抵消糖皮激素的生物學效應，影響其藥物療效，這與本文研究結論相似[19]。

本研究結果顯示，疾病控制組5-HTTLPR基因表達水平明顯低于疾病未控制組，5-HTTVNTR基因表達較疾病未控制組無明顯變化，證實短期激素干預能有效降低5-HTTLPR基因表達。究其根源，AECOPD炎癥性病理改變誘導5-HT大量被釋放，促使5-HTTLPR基因表達水平增加；而短期激素干預能調節5-HT系統功能，促使5-HT受體適應性下調，一定程度上增加了其敏感性，進而對血小板5-HTT表達有抑制作用[20]。本研究雖證實5-HTT基因多態性與AECOPD短期激素干預療效之間存在一定關系，但由于人種及地域的不同可能會使得基因型分布有所不同，從而使藥物療效出現差異，這是否與藥物代謝方面及藥物敏感性方面的種族差異有關尚需進一步驗證。另外，本研究樣本量偏小，可能存在抽樣誤差，故以后研究中需增加樣本量深入探討。

綜上，5-HTTLPR及5-HTTVNTR兩種基因多態性與AECOPD短期激素干預療效之間有關聯，臨床應引起足夠重視。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突