4種不同破紅液對血性胸水富集瘤細胞效果的研究

曾賽凡，王雪丹，陳余朋，張 聲，王行富

人體幾乎所有系統的惡性腫瘤都可能發生漿膜腔播散，以肺癌、胃腸癌、乳腺癌、卵巢癌等多見，其中肺腺癌的轉移最常見[1]，多由腫瘤細胞破壞或瘤栓阻塞淋巴管、血管引起，因此常形成血性漿膜腔積液。通過漿膜腔積液細胞學檢測往往可進行早期診斷，積液沉渣細胞蠟塊制作是重要的補充診斷方法，但由于血性積液中含有大量紅細胞，可能掩蓋腫瘤細胞，對后續的免疫細胞化學染色和分子檢測均可造成困擾。因此，制片前溶解紅細胞，使得腫瘤細胞更為集中，并保持完整的細胞形態和良好的抗原性尤為重要。本研究采用4種常見的低滲紅細胞裂解液進行處理，比較研究對蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-Eosin stain，H-E)及免疫細胞化學染色(immunocytochemical stain，ICC)的效果，報道如下。

1 資料與方法

1.1樣本來源 收集2017年11月-2018年6月送檢并經組織病理證實為肺腺癌的濃血性胸水樣本22例，男性15例，女性7例，年齡(48.50±4.50)歲(45～60歲)。

1.2方法

1.2.1分組 根據所用的破紅液的種類分為4組：A組采用1%乙酸液；B組采用50%乙醇液；C組采用50%乙醇+10%中性緩沖甲醛混合液；D組采用1%乙酸+50%乙醇+10%中性緩沖甲醛混合液，配制后備用。收到樣本后立即搖勻，取4管，各10 mL，分別加入4種破紅液，樣本與破紅液的比例是1∶4，在振蕩器中1 500 r/min充分混勻后，置于離心機中，2 500 r/min離心5 min，可見管底析出沉淀物，再加10%中性緩沖甲醛懸浮固定5 min，離心棄上清液，加75%乙醇混勻立即離心，棄上清液，加入95%乙醇室溫靜置2 h，凝集成塊后取出，用綿紙包裹，脫水包埋制成細胞蠟塊(cell block，CB)，4 μm切片，行H-E染色及ICC染色。

1.2.2ICC染色 采用ULtraVIEW兩步法檢測系統進行檢測，于全自動免疫組織化學染色儀(Roche BenchmarkXT，瑞士羅氏公司)中完成。檢測指標：甲狀腺轉錄因子1(TTF-1，1∶200，8G7G3/1，鼠單抗，北京中杉公司，細胞核)、低分子量角蛋白(CK7，1∶300，OV-TL12/30，鼠單抗，福州邁新公司，細胞質)、上皮細胞表面糖蛋白(MOC-31，1∶100，鼠單抗，福州邁新公司，細胞膜)，陽性對照為肺腺癌組織切片。

1.3評價標準 由兩名副主任病理醫師閱片，評估H-E中紅細胞的數量、腫瘤細胞分布和結構及染色分值(表1)，ICC染色時陽性定位、強度及背景分值(表2)。每張染色片按得分評價：效果差為0～3分(白標)，效果一般為4～6分(灰標)，效果優良為7～9分(藍標)，根據這3種分值制作標記圖。

表1 細胞蠟塊H-E染色結果評價

1.4統計學處理 采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析，非正態分布的數據采用中位數和四分位間距M50(P25～P75)描述，不服從參數檢驗條件時采用秩和檢驗比較4組破紅液作用效果的差異。所有P值為雙側概率檢驗，檢驗水準α為0.05。P<0.001為差別具有統計學意義。

表2 腫瘤細胞ICC染色結果評價

2 結 果

2.1H-E染色效果 4組破紅處理后，H-E染色鏡下均未見或僅有少量的紅細胞，腫瘤細胞可見。但A組腫瘤細胞腫脹、核染色質分散，結構略模糊，染色過紅；B組腫瘤細胞量少，蛋白背景多，結構清晰略有收縮，染色過紅；C組腫瘤細胞多分布均勻，輪廓清晰，形態完整、染色鮮艷；D組部分細胞腫脹、細胞核固縮，染色不均勻(圖1)。C組在H-E染色中效果優良藍色標記最多，D組和B組次之，A組最差(圖2)。4組破紅液在H-E染色中的比較，差別均具有統計學意義(P<0.001，表3)。

2.2ICC染色效果 A組TTF-1只有2例弱陽性，20例未表達，細胞質表達彌散，背景明顯，細胞膜表達尚可；B組細胞量少呈現陽性或弱陽性表達；C組細胞呈均勻一致的棕褐色、陽性細胞數量多、無背景；D組腫瘤細胞表達不均勻，細胞核呈棕黃色、細胞質和膜表達過強，背景明顯(圖1)。C組在抗原定位、陽性強度、背景干凈方面效果優良藍色標記最多，D組次之，A組和B組較差(圖2)。4組破紅液在TTF-1,CK7及MOC-31染色中的比較，差別均具有統計學意義(P<0.001)(表3)。

表3 4組破紅液H-E及ICC染色效果秩和檢驗結果對比

3 討 論

肺腺癌轉移至胸腔產生的血性胸水，因所含的紅細胞量的差異肉眼可呈現深淺不一的紅色，對于深紅色的濃血性胸水常因取材時血細胞過多、而有效腫瘤細胞較少或缺如，從而造成漏診或假陰性[2]。如何破壞紅細胞，使得樣本分層富集腫瘤細胞，是提高此類樣本的細胞病理檢出率的關鍵所在。血性樣本的破紅常常在細胞涂片上進行處理，破紅后制作細胞蠟塊的文獻相對較少[3]。關于體液樣本分離紅細胞采用新型環保裂解劑、過濾裝置技術、Carnoy固定劑及生理鹽水水化技術(normal saline rehydration, NSRT)，均獲得一定的效果[4-6]，但操作技術要求及實驗成本較高。本研究嘗試使用常見的破紅試劑，經反復實驗及組合運用，尋找既能消除紅細胞又能讓腫瘤細胞形態相對保存完整的紅細胞溶解劑。

1%乙酸和50%乙醇作為低滲性的紅細胞溶解劑，溶血效果優良。但在單獨使用時對腫瘤細胞的影響明顯，乙酸會引起腫瘤細胞的膨脹和細胞核的腫脹[7]，乙醇會大量地沉淀蛋白，使得腫瘤細胞分散，細胞輕度收縮。本實驗嘗試了混合破紅液，D組中乙酸和乙醇同時分離紅細胞，破紅的速度最快，乙酸對腫瘤細胞的膨脹和乙醇的收縮作用可以部分抵消，但乙酸和甲醛作為固定劑時的穿透速度比乙醇快，所以部分被及時固定的有核細胞形態完整，蛋白保存尚可，而部分細胞腫脹細胞核收縮。C組中，甲醛液具有滲透能力強、固定均勻、組織收縮小的特點，加上50%乙醇可以消除紅細胞背景，沉淀蛋白形成支架，細胞聚集成塊，二者協同起到固定腫瘤細胞及溶解紅細胞的作用。而且10%中性緩沖甲醛可快速穿透固定腫瘤細胞，避免了乙醇對腫瘤細胞的收縮影響。甲醛與乙醇混合液的配制，二者間不同的混合比例、混合時長等均會造成其分子結構的變化及對組織細胞蛋白質效應的差異[8]。實驗結果顯示，50%的乙醇與10%中性緩沖甲醛混合效果良好。10%中性緩沖甲醛液對于保存細胞的形態和抗原方面更有優勢，尤其是對細胞核的固定最佳[9]。本實驗在抗體標記的定位與強度方面與組織標本有高度的一致性。

A1：H-E染色，腫瘤細胞腫脹、核染色質分散，結構略模糊，染色過紅；A2：TTF-1細胞核未表達；A3：CK7細胞質表達彌散；A4：MOC-31細胞膜表達良好；B1：H-E染色，腫瘤細胞分布于蛋白背景中，細胞收縮，染色過紅；B2～B4：TTF-1，CK7及MOC-31腫瘤細胞少量陽性或弱陽性表達；C1：H-E染色，腫瘤細胞分布均勻，形態完整、染色鮮艷；C2～C4：TTF-1，CK7及MOC-31腫瘤細胞呈棕褐色均勻一致的表達；D1：H-E染色，腫瘤細胞腫脹、細胞核固縮，染色不均勻；D2：TTF-1細胞核呈棕黃色表達；D3～D4：CK7及MOC-31腫瘤細胞表達過強，背景明顯.

圖2 22例樣本H-E及ICC染色分值標記圖

深紅色血性胸水的送檢、取材、破紅、CB制作應及時，以免造成蛋白大量沉淀、紅細胞包裹有核細胞、腫瘤細胞退變等。本次實驗中，樣本21號和22號的分值低，破紅效果不良，可能是送檢不當導致細胞退變引起結構破壞，ICC染色出現特異性著色或不著色，與文獻報道一致[10]。

總之，針對深紅色血性胸水的樣本，不同的破紅液對制作細胞蠟塊H-E染色及ICC染色效果不盡相同，50%乙醇與10%中性緩沖甲醛混合液進行破紅的效果最佳，可能具有推廣應用的價值，但尚需進一步更多樣本及多中心研究，同時，其針對分子病理的影響也需要進一步研究驗證。