玳玳果黃酮降脂提取物4個效應組分的含量測定研究

馬國萍，陳 丹，朱仙慕，劉秀棉，洪麗婷，陳 思, 陳 紅

玳玳(CitrusaurantiumL.vardaidaiTanaka)蕓香科柑桔亞屬植物，為酸橙變種，屬藥食同源中藥[1]。玳玳果黃酮降脂提取物是課題組運用已獲國家發明專利授權的制備工藝制成的總黃酮含量穩定>80%且具有良好的降血脂和抗氧化作用的中藥有效部位提取物[2-5]。研究表明，新橙皮苷、柚皮苷、橙皮內酯水合物、枳屬苷等為其體內主要效應組分[6-7]。為有效控制玳玳果黃酮降脂提取物的質量，本研究擬建立HPLC外標法同時測定玳玳果黃酮降脂提取物中4個主要效應組分新橙皮苷、柚皮苷、橙皮內酯水合物、枳屬苷含量的測定方法，為完善并提升玳玳果黃酮降脂提取物的內控質量標準提供科學依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試藥 新橙皮苷對照品(批號110722-201109，中國食品藥品檢定研究院)；柚皮苷對照品(批號111857-201101，中國食品藥品檢定研究院)；橙皮內酯水合物(純度為98.9%，實驗室自制)、枳屬苷(純度為98.7%，實驗室自制)；玳玳果黃酮提取物(批號20171015，20171114，20171201，自制)；水為超純水；乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

1.1.2儀器 Waters2695高效液相色譜儀；Waters2996檢測器；Empower3色譜工作站；AR2140 萬分之一電子天平，XS205 十萬分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

1.2方法

1.2.1色譜條件與系統適用性實驗 色譜柱250-4 Lichrocart C18(4.0 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈-0.2%醋酸水溶液，程序洗脫；檢測波長284 nm；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL；柱溫30 ℃。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2供試品溶液的制備 精密稱取玳玳果黃酮降脂提取物約10 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻即得。

1.2.3對照品溶液的制備 分別精密稱取新橙皮苷、柚皮苷、橙皮內酯水合物、枳屬苷對照品適量，加甲醇溶解，制得質量濃度分別為1.510，1.036，0.275及0.328 mg/mL的對照品溶液。

1.2.4陰性對照品溶液的制備 取缺玳玳果黃酮降脂提取物的空白溶劑，按“1.2.2”項下同法操作即得。

1.2.5專屬性試驗 分別精密吸取混合對照品溶液、陰性對照溶液及供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.2.6標準曲線制備及線性關系考察 精密量取新橙皮苷對照品溶液 100，305，655，1 005，1 500，2 000 μL，柚皮苷對照品溶液100，250，400，800，1 500，2 000 μL，枳屬苷對照品溶液10，30，50，70，100，200，250 μL，橙皮內酯水合物對照品溶液40，70，100，200，400，450 μL，依次對應，分別放置于2 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度搖勻，即得4個效應組分系列混合對照品溶液。分別精密吸取效應組分系列混合對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標，新橙皮苷、柚皮苷、枳屬苷、橙皮內酯水合物對照品質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.7精密度試驗 精密吸取同一份混合對照品溶液，注入高效液相色譜儀，連續進樣6次，記錄各效應組分峰面積，分別計算相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.2.8重復性試驗 分別精密稱取同一批(批號20171114)玳玳果黃酮降脂提取物粉末約10 mg，6份，按“1.2.2”“1.2.5”項下同法操作，測定，記錄各效應組分峰面積值，計算含量及RSD。

1.2.9穩定性試驗 取同一份供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12，24 h，按“1.2.2”“1.2.5”項下同法操作，測定，分別記錄新橙皮苷、柚皮苷、橙皮內酯水合物、枳屬苷峰面積，分別計算RSD。

1.2.10加樣回收率試驗 分別精密稱取已知含量的玳玳果黃酮降脂提取物約5 mg(批號20171114)6份，分別精密加入適量對照品溶液(每1 mL含新橙皮苷1.510 mg，柚皮苷1.036 mg，橙皮內酯水合物0.275 mg，枳屬苷0.328 mg)，按“1.2.2”“1.2.5”項下同法操作，測定，計算新橙皮苷、柚皮苷、枳屬苷、橙皮內酯水合物的平均回收率及RSD。

1.2.11樣品含量測定 取3批玳玳果黃酮降脂提取物(自制，批號20171015，20171114，20171201)，分別精密稱取提取物粉末約10.0 mg，每批3份，按“1.2.2”“1.2.5”項下同法操作，測定，外標法計算含量。

2 結 果

2.1專屬性試驗 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液，注入液相色譜儀。實驗結果表明，各效應組分色譜峰分離良好，陰性對照無干擾(圖1)。

a：混合對照品； B：陰性對照； C：玳玳黃酮提取物. 1：柚皮苷；2：新橙皮苷；3：橙皮內酯水合物；4：枳屬苷.

2.2標準曲線制備及線性關系考察 新橙皮苷、柚皮苷、橙皮內酯水合物、枳屬苷分別在76.365～1 491.482 μg/mL，49.155～1 024.283 μg/mL，5.134～61.151 μg/mL，1.771～40.962 μg/mL質量濃度范圍內呈良好的線性關系。4個效應組分標準曲線回歸方程及線性范圍見表2。

表2 標準曲線測定結果

2.3精密度試驗 同一份混合對照品溶液，連續進樣6次后測得新橙皮苷、柚皮苷、橙皮內酯水合物及枳屬苷峰面積的RSD分別為0.48%，0.34%，0.92%及1.09%，表明儀器精密度良好(表3)。

表3 精密度試驗結果

RSD：相對標準偏差.

2.4重復性試驗 同一批號20181114的玳玳果黃酮降脂提取物粉末6份，測得新橙皮苷、柚皮苷、橙皮內酯水合物、枳屬苷平均含量分別為372.7 mg/g(RSD=2.26%，n=6)，294.3 mg/g(RSD=2.44%，n=6)，26.70 mg/g(RSD=2.35%，n=6)，15.00 mg/g(RSD=2.49%，n=6),表明該方法重復性良好(表4)。

表4 重復性試驗結果

RSD：相對標準偏差.

2.5穩定性試驗 同一份供試品溶液分別于0，2，4，6，8，12，24 h測得峰面積，計算新橙皮苷、柚皮苷、橙皮內酯水合物及枳屬苷各效應組分RSD分別為0.42%，0.85%，1.95%及1.29%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好(表5)。

2.6加樣回收率試驗 玳玳果黃酮降脂提取物4個效應組分新橙皮苷、柚皮苷、橙皮內酯水合物、枳屬苷加樣回收率結果均符合準確度要求(表6)。

2.7樣品含量測定 3批玳玳果黃酮降脂提取物外標法測定計算得新橙皮苷、柚皮苷、橙皮內酯水合物、枳屬苷含量(表7)。

表5 穩定性考察結果

RSD：相對標準偏差.

表6 加樣回收率試驗結果

RSD：相對標準偏差.

表7 樣品含量測定結果

n=3. RSD：相對標準偏差.

3 討 論

玳玳果黃酮降脂提取物是課題組運用已獲國家發明專利授權的制備工藝制成的總黃酮含量穩定大于80%且具有良好的降血脂和抗氧化作用的中藥有效部位提取物，由其制備的提取物具有多組分群和多靶點作用的特點。課題組研究表明，其體內主要效應組分有新橙皮苷、柚皮苷、枳屬苷、橙皮內酯水合物，其中特征活性成分新橙皮苷、柚皮苷占總黃酮含量60%以上。為有效控制玳玳果黃酮降脂提取物的質量，針對有效部位提取物具備多組分群的特點，通過建立HPLC外標法同時測定玳玳果黃酮降脂提取物活性成分新橙皮苷、柚皮苷、橙皮內酯水合物、枳屬苷的含量，建立可實現多指標組分群質量控制的定量分析方法。

本研究比較了不同柱溫(20，25，30，35 ℃)及進樣量(10，20 μL)對色譜峰分離的影響。結果表明，柱溫20 ℃時，各成分色譜峰分離效果較差且未完全出峰；柱溫25 ℃時，3號色譜峰出現雙峰，分離度受影響；柱溫30℃時，各成分峰達到完全分離且峰形良好；柱溫35 ℃時，成分峰分離良好，但出現色譜峰飄移現象；當進樣量10 μL時，各成分峰在22 min內出峰，分離良好，基線穩定；當進樣量20 μL時，會出現前沿峰。故本研究選取柱溫30 ℃、進樣量10 μL的進樣條件，基線平穩，新橙皮苷、柚皮苷、橙皮內酯水合物、枳屬苷色譜峰達到完全分離。

本研究建立采用HPLC法同時測定玳玳果黃酮降脂提取物中4個主要效應組分新橙皮苷、柚皮苷、橙皮內酯水合物、枳屬苷含量的測定方法，經方法學考察，該方法精密度、重復性、穩定性良好，專屬性強，準確度高，可用于玳玳果黃酮降脂提取物多指標效應組分含量測定的質量監控。