兩種多吡啶釕異構體用于抑制Aβ42纖維化和降低Aβ42細胞毒性的研究

王 彤，李貞華，張園芳，王 祎，張黔玲，師紅東

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種漸進性發展致死性神經退行性疾病。隨著我國人口老化，患AD的人數不斷增加，對老年人的身心健康、社會和家庭造成了嚴重的影響和負擔[1]。AD的發病機制復雜，其主要病理機制學說有β淀粉樣蛋白級聯學說、tau蛋白學說、中樞膽堿能損傷學說、興奮谷氨酸毒性學說等[2～4]。目前被較多認可的是β淀粉樣蛋白級聯學說(amyloid cascade hypothesis)，其觀點是β-淀粉樣肽(amyloid peptide，Aβ肽)在腦部組織中聚集形成沉淀或纖維化，從而導致中樞神經系統損傷[5，6]。因此，抑制Aβ單體發生錯誤折疊或聚集有望減緩AD的發生發展。

目前已報道的Aβ抑制劑主要包括過渡金屬配合物、短肽、有機分子、多金屬氧酸鹽、納米粒子以及配體功能化量子點等[7～10]。2008年，含鄰菲羅啉或其衍生物的鉑配合物(Pt LCl2)被報道能夠抑制Aβ聚集，由此開啟了過渡金屬配合物作為Aβ抑制劑的研究。這些鉑配合物通過共價鍵與Aβ中的金屬結合位點(His-6、-13，-14)結合，配合物中的平面芳香環鄰菲羅啉配體與Aβ的N端疏水區域發生疏水作用，從而能夠有效地抑制Aβ42的聚集并降低神經毒性。后來，釕、銥、銠等過渡金屬配合物也被研究用于抗AD治療[11～13]。在這些過渡金屬配合物中，釕配合物具有優良的化學穩定性和獨特的光物理、電化學性質，并且毒性較低。此外，釕配合物一般具有6配位八面體構型，配合物中的配體可以任意改變，這樣可以使其結構具有多樣性，滿足不同性能的設計要求，因此，釕配合物非常適合用于抑制Aβ聚集的研究[14]。本論文中選擇了兩種在不同位置具有雙羥基取代基的結構相似的多吡啶釕配合物Ru[(phen)2(DHOPIP)]2+(p23OH)和Ru[(phen)2(DHMPIP)]2+(p25OH)，通過ThT熒光、TEM、AFM、MTT等方法研究了這兩種釕配合物對Aβ42纖維化的抑制，探討了羥基取代基位置不同所引起的性質差異，為釕配合物作為Aβ抑制劑的研究提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 細胞株和主要試劑 PC12(大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞株來源于深圳大學生命與海洋科學學院)，用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養，并置于5%二氧化碳的37 ℃ 培養箱中培養，取對數生長期細胞進行實驗。胰蛋白酶(Biosharp)；磷鎢酸(麥克林，上海)；噻唑藍(MTT，sigma-Aldrich，美國)，5 mg/ml 4 MTT溶液配制：在凈化工作臺中，將0.2500 g 噻唑藍固體粉末溶解于50 ml無菌PBS緩沖液中，并用0.22 μmol/L 的濾膜過濾。分裝于1.5 ml EP管中，封口并避光保存于-20 ℃冰箱中，避免反復凍融；DMEM完全培養基(Hyclone，美國)；胎牛血清(FBS，維特森公司，澳洲)；雙抗(青霉素-鏈霉素，Gibico，美國)；磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L PBS，Hyclone，美國)；硫黃素T(ThT，sigma-Aldrich，美國)，1 mmol/L硫黃素T：用毫克天平秤取3.189 mg硫黃素T固體粉末于15 ml離心管中，并用10 ml無菌PBS溶解，避光保存于4 ℃冰箱中；

1.2 實驗方法

1.2.1 配合物的合成 基于已報道的過渡金屬配合物抑制Aβ42的研究，本論文以毒副作用較低的釕作為金屬中心，以具有芳香環的鄰菲羅啉(phen)及2-苯基咪唑并[5，6-f]-1，10鄰菲羅啉(PIP)為配體，并在PIP配體上的不同位置上增加了兩個羥基，合成了兩種結構相似的釕配合物Ru[(phen)2(DHOPIP)]2+(p23OH)和Ru[(phen)2(DHMPIP)]2+(p25OH)，配合物的結構見圖1。

圖1 p23OH和p25OH的化學結構式

1.2.2 釕配合物的光譜性質研究 采用紫外可見吸收光譜和熒光光譜研究了兩種釕配合物Ru 1和Ru 2的光譜學性質。配合物的濃度為5 μmol/L，使用島津紫外分光光度計(UV-2450)進行紫外光譜表征，掃描波長為200～700 nm，掃描數據采取間隔為0.2 nm；使用日立熒光發射光譜儀(F7000)進行熒光光譜表征，配合物的激發波長為450 nm，掃描速度為1200 nm/min，發射和吸收光譜狹縫寬為5 nm，PMT Voltage為500。

1.2.3 PC12細胞培養 將PC12細胞放在含有89%DMEM、10% FBS和1%雙抗的培養液中，并置于37 ℃、飽和濕度為5% CO2的培養箱進行培養。待細胞長滿時，用0.25%的胰酶將細胞消化后，加入培養液吹打均勻，調整細胞密度約為5×106，吸取900 μl細胞懸浮液于2 ml凍存管中并加入100 μl DMSO，輕輕吹打均勻并封口后進行程序性降溫：4 ℃存放30 min，-20 ℃存放2 h，最后置于-80 ℃冰箱中凍存進行保種。復蘇細胞時，將細胞從-80 ℃取出后置于37 ℃水浴鍋至融化，于超凈臺中將含有細胞的培養液轉移至1.5 ml 離心管中，用封口膜封住。1000 r/min離心5 min后在超凈臺中吸除上清液，加入1 ml培養液吹打均勻后轉移至25 cm2培養瓶中并另外加入4 ml培養液進行培養。

1.2.4 MTT法檢測細胞毒性 收集對數生長期細胞制備成細胞懸液(細胞密度約為2×104/ml)，將細胞接種于透明96孔板(每孔約5×103個細胞)，邊緣孔用無菌PBS緩沖液填充，每孔總體積均為100 μl。設置調零孔、對照孔及加藥孔。空白孔為培養液、對照孔及加藥孔為細胞懸浮液，并置于5% CO2、37 ℃培養箱中培養24 h。待細胞貼壁后，對加藥孔進行加藥，并設置4個復孔。在終止培養前4 h，向每孔加入15 μl MTT溶液(5 mg/ml)。終止培養時，小心吸除孔內培養液，向每孔加入150 μl DMSO，并置于搖床低速振蕩10 min。最后，用酶標儀檢測OD為570 nm處測量各孔的吸光值。細胞活性計算公式為：

1.2.5 Aβ42預處理 將2.5 mg Aβ42溶于550 μl冷卻的六氟異丙醇(HFIP)中，充分震蕩后，置于4 ℃搖床中搖晃6 h，使Aβ42充分溶解(單體形態)，均等分裝于5個EP管中，在-80 ℃冰箱中保存。使用前從-80 ℃冰箱取出至冰上溶解后，于冰水浴中超聲2×10 min，并在通風櫥中于冰上將EP管蓋打開，用流速較小的N2吹干，使HFIP充分揮發，管壁內形成透明的Aβ42蛋白膜。再加入55 μl DMSO充分震蕩后于16 ℃水浴中超聲10 min，制備成2 mmol/L的Aβ42單體溶液，并根據需要用10 mmol/L PBS(pH 7.4)稀釋至所需濃度。

1.2.6 ThT熒光實驗 ThT廣泛用于Aβ42聚集動力學的監測。取黑色96孔板，設置好對照孔、加藥孔、背景孔(不加Aβ42)，并設置4個復孔，每孔總體積為150 μl，Aβ42加入后即刻于多功能全波長酶標儀檢測485 nm處熒光值(激發光波長為445 nm)。固定Aβ42終濃度為20 μmol/L，通過改變體系中釕配合物的終濃度(2 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L)，研究釕配合物對Aβ42聚集的影響及釕配合物與Aβ42的作用過程。

1.2.7 原子力顯微鏡(AFM) 將孵育24 h后的Aβ42及Aβ42-配合物的孵育液(各物質濃度均為20 μmol/L)均稀釋至1 μmol/L，移取5 μl稀釋液均勻滴于新鮮剝離的云母片上，靜置5 min后用二次蒸餾水輕輕洗滌2次并置于干燥皿中干燥過夜，最后使用原子力顯微鏡進行觀察，掃描模式為tapping mode。

1.2.8 透射電鏡(TEM) 移取10 μl孵育24 h后的孵育液(各物質濃度均為20 μmol/L)滴于普通微柵支持膜上，靜置20 min后用濾紙從銅網邊緣吸干，滴加10 μl 1.5%的磷鎢酸(pH 7.4)，靜置10 min后用濾紙從銅網邊緣吸干，并置于干燥皿中干燥。最后使用透射電鏡對樣品進行觀察，操作電壓為80 kV。

1.2.9 可溶性Aβ42含量測定 配制釕配合物Aβ42濃度均為20 μmol/L 的孵育液在37 ℃進行孵育，并設置對照組。取不同時間段(6 h、24 h、48 h、96 h)的孵育液進行13800 r/min離心20 min，取上清液進行BCA蛋白定量，每個樣平行4個復孔。

1.2.10 Aβ42內部熒光滴定實驗 配制終濃度為22 μmol/L 的Aβ42單體溶液700 μl，PBS為緩沖液體系，于熒光發射光譜儀記錄270 nm激發下的發射光譜(290～380 nm)，設定掃描速度為1200 nm/min，發射和吸收光譜狹縫寬為5 nm，PMT Voltage為500。并隨后逐次加入5 μl釕配合物、混勻并放置1 min，直至體系熒光幾乎不再變化。計算配合物與Aβ42的淬滅常數、表觀結合常數和結合位點。

2 結 果

2.1 p23OH和p25OH的光譜性質表征 p23OH和p25OH的紫外吸收光譜圖和熒光發射光譜圖比較相似(見圖2)，均在262 nm處有一個IL(Interligand)峰，在450 nm處有一個MLCT(Metal Ligand Charge Transfer)峰；在450 nm光激發下，兩個釕配合物均在579 nm處出現最大發射峰。

2.2 p23OH和p25OH能夠抑制Aβ42聚集 設定Aβ42的終濃度為20 μmol/L，改變配合物的濃度，采用ThT熒光法研究不同濃度的兩種配合物對Aβ42聚集的影響(見圖3)。實驗結果表明，與釕配合物共同孵育后，在前200 min內，Aβ42體系中ThT的熒光強度迅速增加，并在約300 min時ThT熒光值達到最大，然后基本保持穩定不變。隨著配合物濃度的增加，相同時間下ThT的熒光強度增強。改變釕配合物的濃度分別為2 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、和30 μmol/L，與Aβ42共同孵育24 h后，p23OH對Aβ42纖維體形成的抑制率分別位46.49%、58.96%、76.53%、91.35%、96.00%；p25OH對Aβ42纖維體形成的抑制率分別22.54%、27.48%、48.97%、78.79%、84.40%。可見，在相同的實驗條件下，p23OH抑制Aβ42聚集的能力明顯高于p25OH。

2.3 p23OH和p25OH抑制Aβ42聚集的形貌觀察 采用AFM和TEM研究了釕配合物對Aβ42聚集的影響(見圖4)。從AFM實驗結果中可以明顯看出，在沒有釕配合物的存在下，Aβ42形成了密集的分支狀纖維體，形成明顯的纖維狀網絡。而在p23OH或p25OH配合物存在時，體系中觀察不到纖維狀的Aβ42，主要以一些小顆粒存在，猜測為小分子量的寡聚體，且顆粒分子相對較少。TEM的實驗結果中也可以看出，在沒有釕配合物的存在下，Aβ42形成了明顯的聚集體，而在釕配合物存在下，只有分散的顆粒存在。這些結果說明釕配合物可以有效地抑制Aβ42聚集。

2.4 可溶性蛋白含量的測定 纖維化的Aβ蛋白或高分子量的Aβ寡聚體容易被高速離心沉淀下來，而可溶性的Aβ單體及低分子量寡聚體則會存留在上清液中。因此，本論文通過BCA蛋白定量法，取不同時間段(6 h、24 h、48 h、96 h、120 h)的37 ℃孵育液(配合物、Aβ42濃度均為20 μmol/L)在13800 r/min轉速下離心20 min，取上清液測試，確定體系中可溶性蛋白的含量，從而評估不同孵育體系中Aβ的聚集程度(見圖5)。實驗結果表明，隨著孵育時間延長，各體系中可溶性蛋白的含量逐漸降低；相對于沒有加入釕配合物的Aβ42體系，加了釕配合物的孵育液體系中可溶性蛋白的含量明顯較高，且加了p23OH體系中的可溶性蛋白的含量稍高于加了p25OH體系。進一步延長孵育時間，所有體系中的可溶性蛋白含量都明顯降低，這是由于Aβ本身具有較強的疏水性質，從而引起沉淀所致。

2.5 p23OH和p25OH降低Aβ42聚集導致的細胞毒性 為定性評估兩種釕配合物的細胞毒性，我們采用MTT細胞毒性試驗法，通過設置一系列釕配合物的濃度(2 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)，使其與PC12細胞共孵育24 h后，檢測其細胞活性(見圖6A)。實驗結果表明，兩種釕配合物均具有較低的細胞毒性，且p23OH的細胞毒性小于p25OH。配合物的細胞毒性與其濃度呈現正相關，其IC50分別為38.5 μmol/L 和28.5 μmol/L 。我們還做了配合物對Aβ42細胞毒性影響的研究。由于有大量研究表明金屬離子，尤其Zn2+、Cu2+和Fe3+與Aβ聚集有密切關系，且可能增強Aβ的細胞毒性，因此我們研究在Cu2+存在下，有無p23OH或p25OH的情況下對Aβ42聚集導致的細胞毒性的影響(見圖6B)，Cu2+加入對Aβ42導致的細胞毒性影響較小；雖然p23OH和p25OH在10 μmol/L 下對細胞的抑制率約有80%，但加入p23OH或p25OH后，明顯減少了Aβ42纖維化導致的細胞毒性，且p23OH作用比p25OH大，這一結果跟p23OH抑制Aβ42纖維化效果比p25OH好一致。說明p23OH和p25OH能夠降低Aβ42聚集導致的細胞毒性。

2.6 Aβ42內部熒光滴定實驗 含有芳香環的色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸具有自身熒光性質，因此含有酪氨酸殘基的Aβ42多肽具有自發熒光性質，在270 nm光激發下，在290～380 nm范圍內有熒光出現。當Aβ42與其它分子發生相互作用時會使自身熒光降低，熒光強度降低越明顯，說明相互作用越強。向Aβ42體系中逐漸滴加釕配合物，研究了釕配合物與Aβ42的相互作用。設定激發波長為274 nm，向含20μmol/L 的Aβ42體系中逐步滴加釕配合物，隨著釕配合物濃度的增大，體系的熒光強度逐漸下降(見圖7)。采用Stern-Volmer動態熒光淬滅方程[15，16]：F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q](F0和F分別表示有無淬滅劑時體系的熒光強度，Kq為熒光淬滅速率，τ0為熒光分子的熒光壽命，大多數生物分子的熒光壽命可認為是10-8s；KSV為熒光淬滅常數；[Q]為體系中淬滅劑的濃度)。對配合物與Aβ42間的淬滅方式進行表征，從(F0/F-1)-[Q]圖中各數據點可以看出，Stern-Volmer曲線分成兩段線性區間，說明釕配合物與Aβ42之間同時存在著動態熒光淬滅和靜態熒光淬滅兩種淬滅方式。且隨著配合物濃度增加，Stern-Volmer曲線向y軸靠近，說明隨著配合物濃度的增加，配合物對Aβ42的熒光淬滅愈加趨向于動態淬滅。以體系中釕配合物與Aβ42的濃度比([Ru]/[Aβ42])為0.3611作為分界點，對Stern-Volmer曲線進行分段線性擬合并求出各自相對應的Kq、KSV和R2(相關系數的平方)(見圖7、表1)。由于兩種釕配合物使Aβ42內部熒光淬滅的淬滅速率均大于2×1010，因此，p23OH和p25OH兩種配合物使Aβ42熒光淬滅的方式主要為靜態熒光淬滅。但是隨著釕配合物濃度的增加，動態淬滅的效果逐漸增強。釕配合物對Aβ42的靜態淬滅可利用公式log(F0/F-1)= logK+nlog[Qt](K：表觀結合常數；n：結合位點數)來計算淬滅劑與熒光分子間的表觀結合常數及結合位點數(見圖8)，兩種釕配合物與Aβ42的log(F0/F-1)- log[Qt]曲線具有很好的線性相關，具體的線性方程及所求得的表觀結合常數和結合位點數n見表2。從表中可見，兩種釕配合物和Aβ42的表觀結合位點數和結合常數都比較接近，且表觀結合常數都小于0.08 mol/L。說明兩種釕配合物與Aβ42的相互作用較弱，主要以非共價作用形成復合物，如靜電作用、疏水作用和氫鍵作用等。

圖2 Ru[(phen)2(DHOPIP)]2+和 Ru[(phen)2(DHMPIP)]2+的紫外吸收光譜圖(A)及熒光發射光譜圖(B)

圖3 p23OH和p25OH配合物對Aβ42聚集的抑制動力學(Aβ42及ThT均為20 μmol/L，[Ru] = 2 μmol/L，5 μmol/L，10 μmol/L)

圖4 TEM和AFM檢測p23OH和p25OH配合物對Aβ42聚集的影響([Aβ42] = 20 μmol/L，[Ru] = 20 μmol/L)

圖5 釕配合物與Aβ42共同孵育不同時間段的可溶性蛋白含量

圖6 A：不同濃度的p23OH或p25OH作用于PC12細胞24 h后的細胞活性；B：Aβ42在有無Cu2+及釕配合物存在下對PC12的細胞毒性的影響

圖7 釕配合物與Aβ42的熒光滴定譜圖及Stern-Volmer方程的分段線性擬合

圖8 靜態熒光淬滅線性擬合

表1 Stern-Volmer方程分段線性擬合得到的熒光淬滅速率及淬滅常數

表2 配合物與Aβ42的表觀結合常數和結合位點數

3 討 論

隨著人類壽命的增加，特別是我國人口老齡化的加劇，AD嚴重影響著我國人民的生命健康和生活質量。目前所使用的抗AD藥物都只能起到緩解病情的作用，不能根治。因此，開發出能夠有效預防AD的藥物極為迫切。基于β-淀粉樣蛋白級聯學說，研發對Aβ聚集能夠起到調控作用的Aβ調節劑是防治AD的有效策略，也是當今熱門的研究課題。其中，Aβ調節劑可分為能夠抑制Aβ聚集、對Aβ聚集體具有解聚作用、能夠將Aβ轉變為低毒聚集體等類型。近年來，越來越多的過渡金屬配合物被報道具有抑制Aβ聚集的作用。其中，一些釕配合物被報道具有良好的抑制Aβ聚集的效果，并且有些釕配合物還同時具有抑制和監測Aβ聚集的雙功能作用。與其它的金屬配合物相比，釕配合物的毒性較低，是一種潛在的Aβ聚集調節劑，有望開發成為新型的AD藥物。因此，深入開展釕配合物與Aβ的相互作用的研究，對尋找合適的Aβ聚集調節劑具有重要意義。

本論文選取含雙羥基的兩種釕配合物Ru[(phen)2(DHOPIP)]2+(p23OH)和Ru[(phen)2(DHMPIP)]2+(p25OH)，通過ThT熒光、AFM、TEM和可溶性蛋白含量測定等方法研究了兩種釕配合物對Aβ42纖維化的抑制效果。在ThT方法中，硫磺素T(ThT)能夠特異性地識別、結合具有β片層的Aβ纖維體，從而使自身熒光顯著增強，常用于檢測Aβ聚集，體系中熒光強度越大，表明Aβ聚集體越多[17，18]，反之熒光強度越低，表明Aβ聚集體越少，所以可以通過ThT熒光方法檢測釕配合物對Aβ聚集的影響。結果顯示兩種釕配合物都能有效的抑制Aβ聚集，并且呈現出劑量關系，釕配合物的濃度越大，對Aβ42纖維化的抑制效果就越明顯，而且p23OH抑制Aβ42聚集能力明顯高于p25OH 。同時AFM和TEM結果直觀表明在不加釕配合物的時候，Aβ42自身會快速聚集成纖維聚集體，而在p23OH和 p25OH存在下，極大地減少了Aβ42纖維化。可溶性蛋白含量測定也說明兩種釕配合物能夠有效降低Aβ42聚集，增加Aβ42的溶解性。Aβ在腦組織中聚集形成沉淀或纖維化，而對中樞神經細胞產生毒性，造成中樞神經損傷，細胞毒性實驗結果說明，p23OH和 p25OH能夠減弱Aβ42纖維化產生的細胞毒性。熒光滴定實驗結果說明，兩種釕配合物使Aβ42熒光淬滅的方式主要為靜態熒光淬滅。隨著配合物濃度的增加，動態淬滅的效果逐漸增強，靜態淬滅效果減弱。兩種釕配合物與Aβ42結合的表觀結合常數都小于0.08 mol/L，說明兩種釕配合物與Aβ42的相互作用較弱，主要以非共價作用形成復合物，如靜電作用、疏水作用和氫鍵作用等。

綜上所述，本論文中合成的p23OH和 p25OH配合物能夠有效的抑制Aβ纖維化，減弱Aβ42纖維化產生的細胞毒性，說明這兩種釕配合物在治療AD方面可能具有潛在的應用前景。