ULK1基因調節氧糖剝奪所致的SH-SY5Y細胞自噬性死亡

郭文旭，尹昌浩，葛鵬飛，關亞新

缺血性腦卒中是導致成年人死亡和長期殘疾的主要原因之一[1，2]，約占所有卒中患者的87%[3]。目前，靜脈溶栓是改善急性缺血性卒中后果的最有效的藥物治療方法。然而，溶栓治療具有一定的時間窗限制并且可能誘發多種并發癥。因此，治療缺血性卒中需要更好的方法，減少缺血性損傷被認為是治療它的有效措施。

自噬是生物體在進化上相當保守且對細胞穩態具有高度調節作用的一種過程，通過該過程細胞內的大分子物質及受損的細胞器被溶酶體系統進行降解[4]。自噬在細胞命運的調節中可能起著雙重調節作用。一方面，在細胞內部或外部的壓力下，自噬過程促使細胞存活下來，如自噬通過保護腦組織免受癲癇、神經退行性疾病及阿爾茲海默病引起的損害[5～7]。另一方面，過度的細胞自噬通過細胞內相關蛋白及重要細胞器的過度自我降解觸發了非凋亡的程序性死亡(即自噬性死亡)，如海藻糖通過抑制活性氧(ROS)依賴性的內質網應激和AMPK的激活，阻止了SH-SY5Y細胞自噬性死亡[8]。海藻糖通過保護蛋白酶體的活性抑制SH-SY5Y細胞免受OGD誘導的自噬損傷[9]。盡管越來越多的證據表明自噬與缺血性腦卒中、頭部損傷及短暫性腦缺血引發的腦損傷病理過程有關[10～12]，但對于死亡性自噬的具體機制并未完全闡明，考慮到自噬性死亡是導致神經元缺血性損傷的一種途徑[9]，本研究將引用自噬流這一概念，應用siRNA技術體外模擬腦缺血引起的神經元損傷來進一步闡述自噬的具體機制，從而為臨床上減輕缺血性腦損傷提供了一個新的理論依據。SH-SY5Y細胞是人源多巴胺能神經母細胞瘤細胞，在形態學、神經化學和電生理學特性方面與神經元極為相似，并已被廣泛應用于評估神經退行性疾病，腦缺血/再灌注及癲癇引起的神經元損傷或死亡[13]。

1 資料與方法

1.1 試劑 3MA(3-甲基腺嘌呤)(selleck公司 美國)，細胞缺氧培養裝置(比盧普斯羅森堡公司，美國)，MTT購買(碧云天，中國)，小RNA干擾 ULK1(siRNA ULK1)(吉瑪基因 中國上海)。stubRFP-sensGFP-LC3 Lentivirus試劑(吉凱基因化學技術有限公司 中國上海)，抗P-ULK1抗體、抗ULK1抗體、抗Beclin1抗體(CST公司 美國)、抗LC3抗體(sigma公司 美國)、抗P62抗體(abcam公司 美國)、β-actin抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 細胞系及細胞培養 SH-SY5Y細胞獲自中國科學院上海細胞生物學研究所(中國上海)。細胞培養使用10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 μg/ml)的DMEM中培養，并置于在37 ℃和5% CO2潮濕的孵箱中，每周更換培養基兩次。

1.3 MTT法檢測細胞生存率 將對數期生長的SH-SY5Y細胞以每孔(4～5)×103接種到96孔板中，待細胞貼壁后依次加入不同的抑制劑并進行OGD相關處理。于每孔加入20 μl的MTT溶液，培養4 h，棄去培養基加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，搖勻并使用于酶標儀設置參數為OD 490 nm處讀取每個樣品的吸光度值。計算細胞存活率公式：細胞存活率%=樣品組吸光度/對照組吸光度×100%。

1.4 使用SiRAN沉默ULK1基因 將對數期生長的SH-SY5Y細胞(1×104)接種到6孔板中。待次日細胞完全貼壁，更換為無雙抗、無血清的培養基饑餓處理6 h，再使用已配置好的Lipofectamine 3000(Invitrogen，USA)、siRNA ULK1轉染試劑處理48 h，隨后將細胞進行氧糖剝奪24 h并用于隨后的實驗。

siRNA序列信息為：

ULK1-homo-511：-GGUACCACCAGAGCAACAU-

TT-(5’-3’)

Negative Control：-AUGUUGCUCGGGAGGGACCTT-(5’-3’)

1.5 慢病毒轉染SH-SY5Y細胞 選擇狀態良好的SH-SY5Y細胞，嚴格遵循試劑說明書將密度為(3～5)×104個/ml的細胞懸液種植于2.5 cm的培養皿中，置于細胞孵箱中常規培養。參考說明書中的體積更換培養基并加入相應感染增強液，將細胞置于37 ℃孵箱中培育12～16 h后，常規培養。依據漢恒生物慢病毒stubRFP-sensGFP-LC3 Lentivirus使用說明，LC3綠色熒光對于酸性環境下具有不穩定性，在自噬體與溶酶體融合后，在溶酶體內的酸性水解酶作用下，LC3綠色熒光發生淬滅，LC3紅色熒光存在。檢測自噬流開放通過觀察同一個細胞紅色熒光多于綠色熒光來證明。

1.6 氧糖剝奪實驗模型 將對數期生長的細胞7×103接種到96孔板中，于次日對已貼壁的細胞更換為無血清，無糖培養基，然后，放入缺氧培養裝置中并充入已配好的5%CO2和95%N2組成的混合氣體，并置于37 ℃的恒溫孵箱中24 h。

1.7 Western blotting法檢測各組細胞中相關蛋白的變化 使用1500r/min收集各組細胞，并使用PBS清洗兩次，依照細胞的數量加入細胞裂解液于冰上裂解0.5 h，使用BCA法測量并調平蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液100 ℃煮沸10 min并于4 ℃保存。將等量的蛋白質在8%聚丙烯酰胺(SDS)凝膠上電泳并轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore，Billerica，MA，美國)，并與5%的脫脂奶粉于室溫孵育2 h，剪切相應的蛋白條帶孵育抗LC3(1∶1000)、抗ULK1(1∶1000)、抗P-ULK1(1∶1000)于4 ℃冰箱過夜，次日，PBST洗滌3次，每次10 min，然后將免疫印跡膜與辣根過氧化物酶綴合的抗小鼠(1∶2000)或抗兔IgG(1∶2000)在室溫下孵育2 h。最后使用ECL進行曝光顯影。使用Image J進行灰度分析，灰度結果=目的蛋白灰度/β-actin。

2 結 果

2.1 光鏡下各組SH-SY5Y細胞形態學變化與特征 與正常對照組細胞相比，正常實驗組細胞無明顯差異，生長良好，形態成類三角型。與正常對照組相比，OGD對照組的細胞大部分變圓，細胞觸角消失。與OGD對照組相比，OGD實驗組中細胞狀態略好，部分細胞變圓，部分細胞處于正常形態(見圖1)。

2.1.1 各組SH-SY5Y細胞存活率 與正常對照組(100%)相比，正常實驗組的細胞存活率為(0.98±0.01)(P<0.01)。OGD對照組的細胞存活率為(0.55±0.03)(P<0.01)。OGD實驗組的細胞存活率為(0.67±0.02)(P<0.01)(見圖2)。

2.1.2 各組SH-SY5Y細胞中ULK1、P-ULK1、Beclin1、LC3、和P62蛋白表達水平 與正常對照組相比，正常實驗組細胞中P-ULK1、Beclin1、LC3、和P62蛋白均未見明顯變化(P<0.01)，其余各組中ULK1蛋白水平均未見顯著變化(P<0.01)。與正常對照組相比，OGD對照組細胞中P-ULK1、Beclin1、LC3蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)，P62蛋白水平降低(P<0.01)。與OGD對照組相比，OGD實驗組細胞中P-ULK1、Beclin1、LC3蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)，P62蛋白水平升高(P<0.01)(見圖3)。

A：Normal control group；B：3 mmol/L，3MA group；C：OGD group；D：：3 mmol/L，3MA+OGD group

圖1 各組SH-SY5Y細胞形態學表現(×20)

2)P<0.01 compared with control group；3)P<0.01 compared with control group；4)P<0.01 compared with OGD group

圖2 MTT檢測各組細胞存活率

Lane 1：coutrol group；Lane 2：3 mmol/L，3MA group；Lane 3：OGD group；Lane 4：3 mmol/L，3MA+OGD group

2)P<0.01 compared with control group；3)P<0.01 compared with control group；4)P<0.01 compared with OGD group

圖3 各組細胞中P-ULK1、ULK1、Beclin1、LC3、和P62蛋白表達電泳圖

2.2 應用慢病毒感染SH-SY5Y細胞后熒光顯微鏡觀察同一細胞內LC3紅綠熒光蛋白數量差異變化 與OGD處理0 h組細胞中紅色熒光個數(0±1)相比，OGD處理0 h組的細胞中綠熒光蛋白數量(0±1)(P<0.01)無明顯差異。與OGD處理6 h組細胞中紅色熒光個數(3±5)相比，OGD處理6 h組的細胞中綠熒光蛋白數量(3±5)(P<0.05)無顯著差異。與OGD處理12 h組細胞中紅色熒光個數(12±17)相比，OGD處理12 h組的細胞中綠熒光蛋白數量(12±18)(P<0.05)無顯著差異。與OGD處理24 h組細胞中紅色熒光個數(23±27)相比，OGD處理24 h組的細胞中綠熒光蛋白數量(7±9)(P<0.05)顯著降低(見圖4)。

2.3 檢測各組細胞的存活率 與空轉組(100%)相比，scrambled組細胞存活率為(0.98±0.01)(P<0.01)。ULK1 SiRNA組細胞存活率為(0.96±0.02)(P<0.01)。OGD的空轉組細胞存活率為(0.55±0.03)(P<0.01)。OGD的scrambled組細胞存活率為(0.54±0.04)(P<0.05)。OGD的ULK1 SiRNA組細胞存活率為(0.64±0.03)(P<0.01)(見圖5)。

2.3.1 各組SH-SY5Y細胞中UKL1、P-ULK1、Beclin1、LC3、和P62蛋白表達水平 與ULK1 SiRNA組的ULK1、p-ULK1蛋白相比，空轉組和Scrambled SiRNA組的細胞中ULK1、P-ULK1蛋白水平均明顯升高(P<0.01)。與OGD的ULK1 SiRNA組ULK1、P-ULK1蛋白相比，OGD的空轉組和OGD的Scrambled SiRNA組中ULK1、P-ULK1蛋白水平均顯著升高(P<0.01)。與ULK1 SiRNA組的LC3、beclin-1、P62蛋白相比，Scrambled SiRNA組和空轉組的LC3、beclin-1、與P62蛋白均未見明顯變化(P<0.01)。與OGD的SiRNA ULK1組細胞LC3、beclin-1、與P62蛋白相比，OGD的空轉組和OGD的Scrambled SiRNA組細胞中LC3、beclin-1蛋白表達水平顯著增高(P<0.01)，P62蛋白水平明顯下降(P<0.01)(見圖6)。

A：OGD treatment 0 h；B：OGD treatment 6 h；C：OGD treatment 12 h；D：OGD treatment 24 h

A)P<0.01；B)P<0.05；C)P<0.05 red fluorescence compared with green fluorescence；D)P<0.05 red fluorescence compared with green fluorescence

圖4 使用熒光顯微鏡觀察0 h、6 h、12 h和24 h后細胞中LC3紅綠熒光蛋白差異

2)P<0.01，3)P<0.01，4)P<0.01，6)P<0.01 compared with control group；5)P<0.05 compared with control group

圖5 MTT檢測各組細胞存活率

Lane 1：coutrol group；Lane 2：Scambled SiRNA group；Lane 3：ULK1 SiRNA group；Lane 4：OGD group；Lane 5：OGD+Scambled SiRNA group；Lane 6：OGD+ULK1 SiRNA group

1)P<0.01；2)P<0.01 compared with SiRNA ULK1 group；4)P<0.01，5)P<0.01 compared with OGD SiRNA ULK1 group

圖6 各組細胞中P-ULK1、ULK1、Beclin1、LC3、和P62蛋白表達電泳圖

3 討 論

自噬是一種高度保守的蛋白質/細胞器降解系統，負責長期存活的蛋白質的轉換和處理多余或受損的細胞器，以維持細胞的穩態[14，15]。本研究通過對SH-SY5Y細胞進行OGD作用24 h發現，細胞死亡率顯著升高，細胞中的P-ULK1、Beclin-1、LC3蛋白表達水平顯著升高，P62蛋白水平下降，應用3MA自噬抑制劑可以降低細胞的死亡率以及P-ULK1、Beclin-1、LC3蛋白表達水平，挽救了自噬底物蛋白P62的下降。這說明OGD誘導SH-SY5Y細胞自噬水平增強，并最終導致細胞死亡。

ULK1作為自噬途徑的起始蛋白，激活自噬起始復合體，并參與自噬膜的延伸，最終形成成熟的自噬體。研究表明，ULK1在自噬過程中參與多種機制的調節，如白藜蘆醇通過激活AMPK/ULK1途徑和下調mTOR1位點，誘導自噬維持MESC的多能性[16]。ESCs通過依賴AMPK提高ULK1的磷酸化增強自噬水平，平衡能量與生物合成需求，促進細胞復制和自我更新[17]。ULK1蛋白水平可以通過多種刺激進行調節，如營養耗竭、能量缺乏和缺氧等[18～20]。在營養缺乏的初始階段，ULK1蛋白即可被誘導并提高轉錄水平，而ULK1蛋白主要是通過泛素化蛋白酶體途徑進行降解的[21，22]。在之前的研究中發現，OGD可以顯著誘導并降低SH-SY5Y細胞蛋白酶體的活性[9]，ULK1蛋白的持續積累，導致自噬過程持續存在。本實驗應用ULK1基因沉默后，顯著降低OGD誘導的P-ULK1、Beclin1、LC3蛋白在SH-SY5Y細胞中的表達。升高P62蛋白的表達水平；同時能顯著降低OGD誘導SH-SY5Y細胞的死亡率。結果表明沉默ULK1基因降低自噬相關蛋白的表達，進而抑制自噬過程減少了OGD所致SH-SY5Y細胞的死亡。使用熒光顯微鏡觀察轉染慢病毒的SH-SY5Y細胞，隨著OGD處理的時間逐漸延長，細胞中紅色熒光蛋白LC3在0 h、6 h、12 h、24 h表達明顯增多，綠色熒光蛋白在OGD處理0 h、6 h、12 h之前是逐漸增加的，而在24 h時，綠色熒光蛋白數量淬滅。根據紅綠熒光的不同可以發現OGD作用24 h可能誘導SH-SY5Y細胞自噬流開放，導致細胞過度的自我降解，觸發了非凋亡的程序性死亡(即自噬性死亡)。

綜上所述，OGD可以誘導SH-Y5Y細胞自噬，并最終誘導自噬流開放引起過度自噬，敲除ULK1基因或應用自噬抑制劑可以降低細胞內的自噬水平進而阻斷細胞自噬性死亡。這為臨床上通過抑制自噬過程治療腦缺血性神經損傷提供實驗支持，為減緩腦神經缺血損傷提供一個潛在的治療靶點。