辛基酚對萼花臂尾輪蟲毒性效應的研究

李若男，王再興，夏洋，吳建新，陸正和

（淮海工學院海洋生命與水產學院，江蘇 連云港 222005）

環境激素對人類及動物健康的影響已日益引起人們關注[1]。烷基酚聚氧乙烯醚（APEs）為非離子表面活性劑，廣泛應用于洗滌用品、塑料、殺蟲劑等方面，隨著工農業的發展，其對水體的污染日趨嚴重。辛基酚（Octylphenol，簡稱OP）為APEs的合成原料和主要降解產物，目前在土壤和水體中已有發現，為雌性激素最強的烷基酚類化合物，能夠干擾動物的內分泌系統，對動物生長、發育和生殖造成危害[2]，對魚類的生殖影響也有報道[3-5]，但OP對水生浮游動物輪蟲的影響未見報道。

輪蟲為淡水浮游動物的重要組成部分，具有分布廣，繁殖快，生活周期短，易培養，為魚類良好的開口餌料。同時也是水生態毒理學研究中常用的模式動物[6]。其中24 h急性毒性和生命表參數研究為評價環境激素對輪蟲毒性常用的方法[7-8]，同時研究發現輪蟲的有性生殖較無性生殖對環境激素敏感，因此利用輪蟲的生殖評估環境激素效應已成為當前研究的熱點[9]。鑒于目前水體中OP污染有加劇趨勢，該文以萼花臂尾輪蟲為受試動物，研究OP對輪蟲主要生殖影響為利用評價OP潛在危害提供參考。

1 材料與方法

1.1 輪蟲的來源和培養

萼花臂尾輪蟲（Brachionus calyciflorus，簡稱輪蟲）采自淮海工學院校園池塘，挑選單個孤雌生殖雌體，馴化培養2個月后，大量培養并誘導其種群產生休眠卵，以后試驗所用的輪蟲為休眠卵孵化而來，孵化使用EPA培養液（96 mg NaHCO3，60 mg CaSO4，60 mg MgSO4和 4 mg KCl，1 L 去離子水），溫度（25±1）℃，光強 200 lx，L∶D=12∶12，時間 24 h，輪蟲餌料為蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa），該藻使用HB-4培養液培養，達到指數增長期后收集離心，EPA稀釋成所需濃度投喂[10]。

1.2 OP對輪蟲急性毒性試驗

試驗用 OP（4-tert-octylphenol，分析純 99.0%，Sigma-Aldrich公司），先用丙酮將這種酚類物質配成100.0 mg/L母液，然后用EPA將母液稀釋到所需試驗濃度，1周用完。在預試驗基礎上，配制OP濃度為 0.2、0.4、0.8、1.6和 3.2 mg/L，以上濃度中丙酮濃度不超過（0.2%）另設丙酮（0.2%）對照組和空白對照組。挑選剛孵出的輪蟲幼體20只，放入到容有2 mL測試液的培養板中，每個濃度設4個重復。試驗在（25±1）℃，無光的培養箱中進行，24 h后解剖鏡下觀察并記錄每孔中輪蟲死亡數，對死亡數據采用SPSS 17.0軟件中Probit法計算OP對輪蟲24 h的半致死濃度LC50。

1.3 OP對輪蟲主要發育階段和產卵量影響

根據LC50值，配制 OP濃度為 0.01、0.02、0.04、0.08和 0.16 mg/L（分別約為 LC50的 1/90、1/45、2/45、4/45、8/45），另設丙酮（0.2%）對照組和空白對照組。試驗開始時，取剛孵出的輪蟲幼體（＜2 h）1個接入容有1 mL以上測試液（內含0.5×106cells/mL小球藻）的細胞培養板中，為防藻類和輪蟲沉底，每6 h懸浮試管底部藻液，試驗開始的48 h，每隔3～4 h觀察1次，記錄輪蟲首次產卵及產幼時間，最后1次產卵時間和產幼時間并記錄輪蟲產卵數，及時移去新生的幼體，每隔24 h更換1次培養液，各測試組重復5次，試驗至全部個體死亡為止[11]。

1.4 OP對輪蟲2 d的r和7 d休眠卵產卵影響

取剛孵出的輪蟲幼體6個，接入到含有12 mL以上測試液的14 mL的試管中（內含3.0×106ells/mL小球藻），每6 h懸浮試管底部藻液，2 d后將試管中輪蟲倒入培養皿中統計輪蟲數量，統計后將所有輪蟲全部移入原來試管中繼續培養，7 d后統計輪蟲休眠卵的數量，休眠卵數量包括攜有性雌體所攜的休眠卵，試驗設丙酮對照組與空白對照組，每組設5個重復，試驗在溫度（25±1）℃，黑暗中進行[12-13]。

1.5 相關參數的定義和分析方法

各主要發育階段：胚胎發育期（指從卵產出到幼體孵出所經歷的時間）；繁殖期（幼體孵出到產第1枚卵所經歷時間）；繁殖期（指從第1枚卵產出到最后1枚卵產出經歷時間）。

平均壽命（繁殖前期、繁殖期、繁殖后期之和）；r：種群增長率（population growth rate）：r=(lnNt-lnN0)/t，Nt和N0分別為試驗經過t天和試驗開始時的種群數量，t=2 d；休眠卵產量（resting egg production，RE）：輪蟲在7 d內所產的休眠卵數量。

對試驗結果使用SPSS軟件進行方差分析（one-way ANOVA），對于有統計學意義差異的與對照組相比進行Dunnett's分析，使用sigmaplot 11.0作圖和數據進行擬合。

2 結果與分析

2.1 OP對輪蟲24 h急性毒性

24 h急性毒性下丙酮對照組與空白對照組中輪蟲病死率分別為5.0%與3.75%，經t檢驗無統計學意義差異（P＞0.05），因此可得出該試驗中丙酮添加對試驗結果無顯著影響。通過空白對照組進行LC50計算，OP濃度對數與病死率關系見圖1。從圖1中可以看出，24 h急性毒性試驗中，輪蟲病死率隨著OP 的濃度增加而上升，OP 濃度0.2、0.4、0.8、1.6 和3.2mg/L下，輪蟲病死率分別為8.75%、23.75%、42.5%、65.0%和92.5%，通過Probit計算方程Y=2.14X+0.214，（Y 概率值，X 為濃度對數），LC50為 0.91 mg/L，95%置信限為 0.66～1.27 mg/L。

圖1 OP濃度對數與病死率關系

2.2 OP對輪蟲主要生活階段和產卵量影響

OP對輪蟲主要發育階段歷時和產卵量影響見表1。從表1中可以看出，丙酮對照組與空白對照組之間對輪蟲的生殖前期、生殖期、生殖后期、平均壽命及產卵量無顯著影響（P＞0.05），而OP顯著影響以上指標（P＜0.05）。與對照組相比，OP濃度在0.08、0.16 mg/L顯著降低輪蟲生殖前期、生殖期、生殖后期和平均壽命（P＜0.05），其他濃度無顯著影響（P＞0.05），OP濃度在0.04 mg/L顯著降低輪蟲的生殖量（P＜0.05），而以上測試濃度對輪蟲胚胎發育無影響（P＞0.05）。

表1 OP對輪蟲主要發育階段歷時和產卵量影響

2.3 OP對輪蟲2 d生殖參數影響

試驗顯示丙酮對照組與空白對照（0 mg/L）無統計學意義差異（P＞0.05），但空白對照組與濃度為0.08和0.16 mg/L輪蟲2 d的r具有統計學意義差異（P＜0.05）。OP對輪蟲2 d的r影響情況見圖2。對OP與r值效應關系，從圖2中可以通過Four-parmeter logstic方程Y=min+(max-min)/[1+x/EC50]-Hilslope得到很好擬合，得出曲線為Y=0.49+(0.825-0.49)/(1+(x/EC50)-3.82，半效應濃度 EC50為0.053 mg/L。

圖2 OP對輪蟲2 d的r影響

2.4 OP對萼花臂尾輪蟲7 d的休眠卵影響

OP對輪蟲7 d的休眠卵影響見圖3。從圖3中可以看出，OP濃度對輪蟲7 d的休眠卵產量具有顯著影響（P＜0.05），從濃度為 0.01～0.16 mg/L，輪蟲7 d所產休眠卵產量平均分別為 21.4、11.4、12.2、6.8 和4.4個，而丙酮對照組和空白對照組休眠卵產卵分別為 32.6和 30.2個，無統計學意義差異（P＞0.05），而其他濃度組所產休眠卵產量與空白對照組相比呈顯著下降（P＜0.05），對濃度與休眠卵產量效應關系，利用Four-parmeter logstic方程Y=min+(max-min)/[1+x/EC50]-Hilslope擬合，得出曲線為Y=3.78+(30.35-3.78)/(1+(x/EC50)-1.22，EC50為 0.014 mg/L。

圖3 OP對輪蟲7 d的休眠卵影響

3 討論

3.1 OP對輪蟲的24 h急性毒性

OP為烷基酚類化合物中具有代表性的環境雌激素，有關其對水生動物的急性毒性影響已有報道，如OP對泥鰍 24的LC50分別為 3.27 mg/L[14]，對中國林蛙蝌蚪的LC50為0.73 mg/L[15]。該研究顯示OP對輪蟲24 h的LC50為0.91 mg/L，因此利用輪蟲24 h急性毒性評價OP明顯比泥鰍24 h毒性急性敏感，但敏感性低于中國林蛙。

3.2 OP對輪蟲主要生活階段和生殖量影響

由于OP對水生動物的生長、發育和生殖具有潛在的毒性作用，因此利用水生動物上述指標評價OP環境激素效應具有明顯的優勢。如劉正濤等研究了OP對大型溞21 d的生殖影響，發現OP濃度0.08 mg/L能降低大型溞的生殖量降低，增加溞類后代中雄性比例[16]；OP濃度0.45 mg/L能降低日本青鳉卵孵化率，使魚鰾發育異常[17]；OP對斑馬魚胚胎發育72 h的半效應濃度為0.5 mg/L[18]。

與魚類等動物相比，輪蟲具有個體小，生命周期短，易培養、對毒物敏感強等優點，因此在評價環境激素效應方面具有一定優勢。該研究結果顯示，OP濃度0.08、0.16 mg/L雖對輪蟲胚胎發育無影響，但對個體的成熟（生殖前期延長）、生殖生殖期及壽命都具有抑制作用，徐曉平等研究溴氰菊酯對萼花臂尾輪蟲生殖時也發現類似結果，其推測生殖前期的延長可能是導致輪蟲種群增長下降的主要原因[19]。

OP濃度0.02 mg/L時顯著延長輪蟲的生殖期，但濃度0.08、0.16 mg/L顯著降低輪蟲生殖期、壽命、生殖量，推測輪蟲可能在OP低劑量脅迫下對生殖、壽命與生殖量之間進行生態策略的權衡，但在高劑量毒性作用下，輪蟲對以上權衡指標被破壞，使得上述指標下降。該研究顯示輪蟲生殖量比生活階段歷時在評價環境激素效應時具有較高的敏感性，因此，輪蟲生殖量為評價OP環境激素效應時具有一定優勢。

3.3 OP對輪蟲2 d的r值影響

魚類的卵黃原蛋白（VTG）常作為評價污染物具有環境雌激素效應的標記物之一。吳翠琴等[3]研究發現OP濃度0.02 mg/L能夠顯著誘導真鯛幼魚產生VTG，宮向紅等[4]研究發現OP濃度0.01 mg/L能誘導鯉魚幼魚產生VTG，而該濃度對魚的生存率、性腺指數沒有變化。雷忻等[20]研究發現OP濃度0.12 mg/L能夠誘導泥鰍雄魚產生VTG，而該濃度對泥鰍肝臟的SOD、CAT無顯著影響，該研究顯示輪蟲暴露在OP濃度0.08 mg/L下2 d的r顯著下降，利用輪蟲2 d的r評價OP環境激素效應時其敏感性明顯低于真鯛和鯉魚，但高于泥鰍。Snell等也認為輪蟲2 d的生活周期測試評價毒物敏感性高于24 h急性毒性LC50值，該研究顯示輪蟲2 d的r的EC50為0.053 mg/L，明顯低于24 h的LC50為0.92 mg/L。

3.4 OP對輪蟲7 d休眠卵產量影響

輪蟲休眠卵為有性生殖的最終產物，其形成受溫度、鹽度、污染物等因素影響。Preston等[21]研究表明，萼花臂尾輪蟲種群暴露在PCP濃度0.0025 mg/L和Cu2+濃度0.005 mg/L下其4 d休眠卵產量與對照組相比顯著下降，但上述濃度對輪蟲病死率、游泳行為、種群增長、混交率等指標卻無顯著變化。輪蟲種群暴露在二嗪農、殺螟硫磷等農藥下7 d休眠卵產量也與出現類似現象[22]，對此Snell等[13]研究認為輪蟲休眠卵產量為評價環境激素效應最敏感的指標。該研究結果顯示OP濃度0.01 mg/L能顯著降低輪蟲7 d的休眠卵產量，顯示輪蟲7 d休眠卵產量評價OP環境激素效應比輪蟲生殖階段指標敏感、2 d的r敏感，同時也發現該濃度比泥鰍，真鯛誘導VTG所需的OP濃度要低[3]，因此輪蟲休眠卵產量在評價OP環境激素效應方面具有操作簡單，費用較少等優點。

綜上所述，水體中OP超過一定濃度會干擾輪蟲的生殖，最終會影響輪蟲的種群數量變化，其種群變化及OP通過食物鏈傳遞可能會對魚類的生長、發育及生殖產生影響，因此有必要對水體中OP進行監控，防止其對水體的進一步污染。

颶風多里安致加拿大貝類養殖業受災

2019年9月8日，大西洋颶風多里安（Dorian）橫掃北美，在加拿大沿海地區制造100 mm強降水，加拿大海洋漁業局通知，愛德華王子島、新斯科舍省和新不倫瑞克省的貝類收成要暫停一周以上。

漁業局稱，食用被污染的貝類可能造成嚴重的疾病甚至死亡，即便高溫煮熟也不能降解毒素。

新斯科舍水產養殖協會主席Tom Smith表示，颶風多里安使該地區多處牡蠣、貽貝、蛤蜊、扇貝和海藻的養殖遭遇損失，尤其是牡蠣養殖業，受損率達到了50%以上。2018年，新斯科舍水產養殖業收入超過1.2億加元。

加拿大媒體CBC報道，颶風過后幾十家愛德華王子島貽貝和牡蠣養殖戶的災后清理活動持續了一周，目前還無法估算損失額。該地區擁有130家貽貝養殖場，年產量18 600 t，占加拿大產量的80%，產值約6 000萬加幣；牡蠣養產量約907 184.74 kg，產值200萬加元。

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