浦口區草魚、鯽魚致病菌的分離鑒定和耐藥性分析

張仁展，蔡德森，江青松

（南京市浦口區水產技術指導站，江蘇 南京 211800）

浦口區共有水產養殖面積2 400 hm2，其中常規魚養殖分布在永寧、湯泉和星甸街道，以草魚、鯽魚為主，面積約680 hm2。每年細菌性病害對浦口區草魚和鯽魚的養殖都會造成一定損失，為了解致病菌的耐藥情況，從不同養殖地點采集草魚和鯽魚，分離體內致病菌，同時進行體外藥敏試驗，為全區水生動物細菌性疾病的科學用藥提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2017年6月—2018年10月，在各養殖集中區池塘共采集草魚發病樣品9個、鯽魚發病樣品26個。分別取肝、腎或脾進行細菌培養分離。

1.2 主要試劑

非苛養非腸道革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒（API 20NE）購自上海嘉合生物科技有限公司。藥敏板購自南京菲恩醫療科技有限公司，營養瓊脂、RS瓊脂、脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂培養基購自北京陸橋生物技術有限責任公司。

1.3 菌株分離與純化

使用滅菌棉簽蘸取發病樣品肝臟、腎臟或脾臟，均勻涂布于營養瓊脂培養基，28℃培養18～24 h，分離出單個菌落，并用接種環挑取單菌落，繼續劃線接種于營養瓊脂培養基，28℃培養18～24 h，進一步純化。

1.4 菌株致病性判斷

經2次分離純化后的菌落，接種于脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂培養基，28℃培養18～24 h，若菌落周圍出現清晰、透明的溶蛋白圈，則判定為具有致病性。

1.5 菌株鑒定

用接種環挑取純化后的單菌落于生理鹽水中，制成0.5 MCF的菌懸液，按操作要求將菌懸液分別接種到細菌鑒定試劑條（API 20NE）小管中，于30℃培養18～24 h。取試劑條與結果讀取表比對得出反應結果數據，通過API 20NE菌譜檢索手冊得到鑒定結果。從35個樣品中，共分離出菌株52株（2017年和2018年各分離出26株），其中嗜水氣單胞菌35株，溫和氣單胞菌8株，創傷弧菌4株，熒光假單胞菌1株，洋蔥伯克霍爾德菌4株。

1.6 最小抑菌濃度的測定

利用定制藥敏板（96孔板）測定恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、紅霉素、乳酸環丙沙星、鹽酸土霉素、強力霉素共8種常見藥物的敏感程度（其中紅霉素和乳酸環丙沙星為水產養殖禁用漁藥，該文不作分析）。首先用接種環挑取純化后的單菌落于生理鹽水中，制成0.5 MCF的菌懸液，從中吸取0.2 mL加入到20 mL無菌生理鹽水中，混勻，倒入經滅菌的V形槽內，然后用排槍移液器吸取該混合液，加入藥敏板所有的小孔中（第二列陰性對照除外），每孔0.2 mL，并在陰性對照孔中加入等量生理鹽水。蓋好試劑板，置于35℃培養箱培養18～24 h（必要時延長培養時間）。經肉眼觀察證實無細菌生長小孔中的最低藥物濃度，即為藥物的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

2 結果與討論

2.1 嗜水氣單胞菌對抗菌藥物的感受性

嗜水氣單胞菌廣泛分布于自然環境中和水生動物體內，是一種典型的條件致病菌，可大規模引起淡水魚類皮膚潰瘍和急性出血性敗血癥[1]，是一類危害極其嚴重的水產動物病原菌。35株嗜水氣單胞菌對各種抗菌藥物感受性測定結果如表1所示。

2.2 溫和氣單胞菌對抗菌藥物的感受性

溫和氣單胞菌可引起多種魚類患細菌性敗血癥和腸道疾病[2]。8株溫和氣單胞菌對各種抗菌藥物感受性測定結果如表2所示。

2.3 創傷弧菌對抗菌藥物的感受性

創傷弧菌可引發水生動物敗血癥和多種炎癥[3]。4株創傷弧菌對各種抗菌藥物感受性測定結果如表3所示。

表1 嗜水氣單胞菌對各種抗菌藥物的感受性

表2 溫和氣單胞菌對各種抗菌藥物的感受性

表3 創傷弧菌對各種抗菌藥物的感受性

2.4 熒光假單胞菌對抗菌藥物的感受性

熒光假單胞菌是引起水生動物赤皮等疾病的致病細菌。1株熒光氣單胞菌對各種抗菌藥物感受性測定結果如表4所示。

2.5 洋蔥伯克霍爾德菌對抗菌藥物的感受性

在實驗過程中還篩選到4株洋蔥伯克霍爾德菌，其對各種抗菌藥物感受性測定結果如表5所示。

表4 熒光假單胞菌對各種抗菌藥物的感受性

表5 洋蔥伯克霍爾德菌對各種抗菌藥物的感受性

不同抗生素的藥敏試驗敏感性結果判定標準有所不同，參照動物源細菌藥敏試驗標準（CLSI M100-S23），對藥物的敏感性及耐藥性判定范圍劃分如表6所示。依據這一劃分范圍，將所有抗菌藥物對各表中菌株的MIC值測定結果進行判定，得出了所有菌株對各抗生素的感受性結果[4]，如表7所示。

表6 藥物的敏感性及耐藥性判定范圍劃分 μg/mL

從試驗結果分析，采樣分離到的病原菌對不同抗生素類藥物表現了不同程度上的敏感性和耐藥性。其中，分離菌株對恩諾沙星、硫酸新霉素這2種藥物敏感率很高，均在90%以上，對強力霉素敏感率相對較高為75%，說明這3種藥物對一些水生動物病原菌有較好的抗菌效果，而分離菌株對甲砜霉素耐藥率最高，達到71.15%，這說明甲砜霉素的抗菌效果相對較差。

表7 所有菌株對供試藥物感受性測定結果 %

如表8所示，比較2017年和2018年分離菌株的MIC加權平均值（MIC加權平均值=Σ（菌株數×對應的MIC值）/菌株總數）[5]，可看出，恩諾沙星和硫酸新霉素的MIC加權平均值分別下降了75.21%和69.05%，表明2年內病原菌對這兩種藥物的耐藥性降低；而甲砜霉素和氟苯尼考的MIC加權平均值分別提高了143.64%和693.59%，這表明病原菌對這兩種藥物的耐藥性顯著增強，尤其是氟苯尼考，這可能與現階段水產養殖過程中頻繁使用該藥有關。

表8 分離菌株的MIC加權平均值 μg/mL

從試驗結果來看，水產病原菌已對多種抗生素產生了不同程度的耐藥性。因此，水產從業者在治療細菌性疾病時，應當科學選擇用藥的種類和劑量，避免將同類抗菌藥物在同一個養殖環境下多次使用；同時也要著重加強水生動物免疫系統建設，進一步增強水生動物自身抗病能力；此外，還應嚴格遵守休藥期制度，多方面綜合把關才能減緩致病菌耐藥性的產生。