Calpain2在FN誘導的口腔鱗癌細胞上皮間質轉化中的作用

張玉蓮 龔靖淋 劉一秀 李真華 周曉紅 葉果

口腔鱗狀細胞癌（OSCC）為常見的惡性腫瘤之一，盡管患者術后經化療控制病情發展，但5年生存率仍不足50%［1-2］。因此，尋求新的治療手段成為臨床治療OSCC的新希望。上皮-間質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT）是近年來腫瘤發生發展的研究熱點，EMT的發生被認為是癌癥轉移的啟動過程，其可使上皮細胞來源的惡性腫瘤獲得侵襲能力［3］。研究發現，鈣激活中性蛋白酶2（calcium-activated neutral protease2，calpain2）過表達可通過腎細胞癌中的AKT/mTOR信號傳導促進細胞轉移和增殖［4］。另有研究發現，在乳腺癌中纖連蛋白（fibronectin，FN）誘導MCF-7細胞EMT的同時伴隨Calpain1和Cal-pain2蛋白表達的上調［5］。這些說明Calpain2可能參與包括EMT在內的腫瘤細胞的多種惡性生物學行為。因此本實驗以口腔鱗癌Tca8113細胞為研究模型，FN誘導模型細胞EMT，觀察Calpain2在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人口腔鱗癌Tca8113細胞（中國科學院上海細胞庫）。

1.1.2 試劑 RPMI 1640培養基、胎牛血清（FBS）、磷酸鹽緩沖液（PBS）（Gibco公司，美國）；FN（Sigma公司，美國）；總蛋白提取試劑盒和細胞裂解液（上海碧云天公司）；Calpain2 siRNA轉染試劑盒（上海吉瑪公司）；抗E-cadherin抗體（貨號3195）和抗Twist抗體（46702）（CST公司，美國）；抗Calpain2抗體（sc-373966）（Santa Cruz公司，美國）；抗GAPDH 抗體（AP0063，內參）、羊抗小鼠IgG-HRP及羊抗兔IgGHRP（BS13278和BS12478）（南京巴傲得公司）；聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）（Millipore公司，美國）。

1.1.3 儀器 20、200和1 000μl移液器（Gilson公司，法國）；CKX41倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；Allegra 64R Centrifuge臺式高速冷凍離心機（Beckman Coulter公司，美國）；SW-CJ-2FD超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；DYY-7C電泳儀（GE公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人口腔鱗癌Tca8113細胞以含12% FBS及1%青鏈霉素的RPMI 1640高糖培養基培養；細胞放置于37℃、5%CO2的培養箱中，生長至70%匯合度進行傳代。

1.2.2 侵襲小室實驗檢測細胞的侵襲能力 實驗前拿出Matrigel膠放于冰上融化。用RPMI 1640培養基稀釋Matrigel膠至濃度為250μg/ml。吸取稀釋好的培養基基質膠混合物100μl于小室中，避免打入氣泡。將培養板放置到培養箱靜置3 h。將同步化24 h的Tca8113細胞或siRNA處理過的Tca8113細胞消化制成細胞懸液并調整細胞密度至1×106個/ml，吸取混合均勻的細胞懸液200μl輕輕加入Transwell小室。在小室外的24孔板下室中加入800μl含趨化因子及高濃度FBS的RPMI 1640培養基，放置于培養箱培養24 h。24 h后倒掉侵襲小室中的培養基并用PBS洗2遍，甲醇固定20 min，PBS洗2遍，放入到0.5%結晶紫水溶液中染色20 min，PBS洗2遍，用棉簽輕輕擦掉小室內房細胞，放置5～10 min風干。倒置顯微鏡下觀察并取6個視野拍照并計數，計算侵襲率。

1.2.3 蛋白印跡檢測蛋白表達 用總蛋白提取試劑RIPA細胞裂解液（使用前20 min加蛋白酶抑制劑，使其終濃度為1 mmol/L）裂解細胞，12 000 r/min離心20 min，吸取上清，采用BCA試劑盒蛋白定量，計算并制備樣品。進行蛋白印記檢測，每泳道上樣量為30 μg，SDS-PAGE電泳分離蛋白，然后將分離蛋白電轉移至PVDF膜上；配制5%脫脂牛奶封閉PVDF膜2 h，TBST緩沖液洗膜3次，每次15 min；然后按要求加入Calpain2抗體（1∶1 000）、Twist抗體（1∶1 000）或E-cadherin抗體（1∶1 000）等4℃孵育過夜。一抗處理后，TBST洗膜3次，再加入相應的辣根過氧化物酶標記二抗（1∶2 000），室溫雜交1 h，PVDF膜以化學發光試劑盒進行顯色，Syngene Imaging System進行成像，以Image J對蛋白印跡條帶進行處理和分析。

1.2.4 siRNA轉染沉默Calpain2表達 轉染前24 h用1 ml高糖1640全培養基將模型細胞接種在6孔板上，每孔4×105個細胞，待細胞匯合度達到70% ～90%時，更換培養基。siRNA的轉染濃度為60 pmol/ml，提前準備配制siRNA-lipo2000混合液，預先將lipo2000試劑輕輕搖勻，按需取出適量，用高糖1640培養基稀釋并輕輕混合，常溫放置5 min；高糖1640培養基稀釋siRNA，輕輕混合；將稀釋好的lipo2000與稀釋好的siRNA混合并輕輕混勻，常溫放置20 min以形成siRNA-lipo2000混合物。設立Calpain2轉染組（siRNA-Calpain2）和空載對照組（siRNA-NC），將相應siRNA-lipo2000混合液加入含有細胞以及培養液的6孔板中，十字搖晃混合。將培養板置于37℃的CO2培養箱中24 h后進行其他實驗。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件對實驗結果進行統計學分析處理，數據以±s表示，統計量n=6。整體數據分布不符合正態分布，組內兩樣本比較用Mann-whitney檢驗。檢驗水準α=0.05，P＜0.05差異有統計學意義（雙尾）。

2 結 果

2.1 FN對Tca8113細胞Calpain2及EMT標志物的影響

Western blot檢測Calpain2、Twist和E-cadherin蛋白表達水平；FN（15μg/ml）處理Tca8113細胞12、24、48 h發現，各時間點Calpain2、Twist和E-cadherin相對蛋白表達量，與0 h相比，Calpain和Twist蛋白表達逐漸增加，差異具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；E-cadherin蛋白表達逐漸降低（P＜0.05或P＜0.01）（圖1）。

2.2 FN對Tca8113細胞侵襲能力的影響

侵襲小室實驗觀察FN對Tca8113細胞侵襲能力的影響，與空白對照組（Control）相比，FN（15μg/ml）組細胞侵襲數增加了（116.7±5.1）%（圖2）。

圖1 FN對Tca8113細胞Calpain2、Twist和E-cadherin蛋白表達的影響Fig 1 The effect of FN on the expression of Calpain2，Twist and E-cadherin proteins in Tca8113 cells

圖2 FN對Tca8113細胞侵襲能力的影響（結晶紫染色，×100）Fig 2 The effect of FN on the invasion ability of Tca8113 cells（Crystal violet staining，×100）

2.3 Calpain2沉默對FN誘導的Tca8113細胞EMT標志物的影響

siRNA轉染沉默Calpain2蛋白表達，FN處理各組細胞48 h。與siRNA-NC組相比，siRNA-Calpain2組蛋白表達下調（90.3±3.3）%（P＜0.01）。與siRNANC組相比，siRNA-Calpain2組由FN誘導的E-cadherin蛋白表達下調及Twist蛋白表達上調被逆轉（P＜0.01）（圖3）。

2.4 Calpain2沉默對FN誘導的Tca8113細胞侵襲能力的影響

siRNA轉染沉默Calpain2蛋白表達，FN處理各組細胞48 h。與siRNA-NC組相比，siRNA-Calpain2組細胞侵襲數下降（51.3±4.5）%（P＜0.01）（圖4）。

圖3 Calpain2沉默對FN誘導的Tca8113細胞Twist和E-cadherin蛋白表達的影響Fig3 The effect of calpain2 silencing on FN-induced Twist and E-cadherin protein expression in Tca8113 cells

圖4 Calpain2沉默后FN對Tca8113細胞侵襲能力的影響（結晶紫染色，×100）Fig 4 The effect of FN on the invasive ability of Tca8113 cells after Calpain2 silencing（Crystal violet staining，×100）

3 討 論

EMT在乳腺癌、肝癌、胰腺癌等腫瘤的發生發展中扮演了重要角色［6］。研究報道，口腔鱗癌細胞發生EMT伴隨細胞遷移和侵襲能力的增強［7］。而EMT的發生機制為細胞E-Cadherin蛋白的減少或丟失以及N-鈣黏蛋白、波形蛋白（Vimentin）或FN等間質表型蛋白表達上調［8］。另外Twist蛋白表達上調也為EMT的標志之一，其為一個高度保守的轉錄因子，可與E-cadherin結合并抑制后者的活性。

本研究以FN刺激Tca8113細胞后發現模型細胞E-cadherin蛋白表達下調，Twist蛋白表達上調，同時細胞侵襲能力增強。提示FN誘導Tca8113細胞發生EMT。進一步實驗發現FN還可誘導Calpain2蛋白表達的上調。為觀察Calpain2在FN誘導Tca8113細胞EMT中的作用，本研究采用siRNA轉染沉默Calpain2蛋白表達，再以FN刺激模型細胞。結果發現沉默Calpain2后，模型細胞Tca8113由FN誘導的E-cadherin表達下調和Twist表達上調被逆轉，FN刺激誘導Tca8113細胞的侵襲活動被抑制。提示，Calpain2可能參與FN誘導的模型細胞Tca8113發生EMT。研究報道，作為Calpain2調節亞基的Calpain4可通過Wnt/βcatenin信號通路的激活促進人黑素瘤細胞EMT［9］。在乳腺癌中，Calpain2可通過MAPK的介導調節乳腺癌細胞MDA-MB-231遷移及黏附［10］。最新研究發現，Calpain2可能參與調節正常乳腺上皮細胞MCF-10A細胞EMT［11］。這些都提示Calpain2與EMT可能存在潛在的調控關系。而Calpain2參與調節口腔鱗癌細胞Tca8113為本研究首次發現，圍繞Calpain2或其下游信號靶點進行研究可能為臨床治療口腔鱗癌提供實驗依據。

文獻已報道Calpain2參與了腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲以及凋亡的調控［9-10，12］，但其具體的調控機制還未完全明了，有待于進一步的實驗研究。因此，本實驗組未來會對Calpain2下游信號靶點就行研究探索，為豐富Calpain2的生物學效應做出一定的努力。總之，本研究發現FN能誘導口腔鱗癌Tca8113細胞發生EMT，該作用可能與Calpain2蛋白表達上調相關。