實驗性牙移動及其引起的咬合改變對牙周神經末梢分布及相關蛋白表達的影響

張羽博翰 楊鴻旭 王美青 鹿蕾

牙周神經末梢可感受牙齒承受的咬合力和正畸矯治力［1］。正畸牙移動可造成牙周膜的形態變化［2］，致牙周神經末梢出現超微結構變化［3］。咬合改變也可影響牙周神經末梢的形態［4-6］。蛋白基因產物9.5（protein gene product 9.5，PGP 9.5）可用以標記牙周神經末梢［7］。牙周膜內的終末雪旺細胞對牙周神經末梢有重要的支持、營養和功能輔助作用［8-9］。

本實驗旨在研究實驗性牙移動及其引起的咬合改變可否影響牙周神經末梢標記物PGP 9.5、終末雪旺細胞標記物S-100和神經營養素-3（neurotrophin-3，NT-3）的表達。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和牙齒移動及咬合改變模型

48只雌性SD大鼠（8周齡，體重200～220 g），購買自第四軍醫大學實驗動物中心。隨機分為實驗組和對照組（各24只）。

實驗組大鼠，1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）全麻，用一段正畸橡皮圈（3 M Unitek，3/16#）進行分牙操作，即將橡皮圈塞入左上第二磨牙和第三磨牙之間，以及右下第二磨牙和第三磨牙之間。確保皮筋不高出平面。皮筋自身的彈力及遇唾液后的膨脹力，推左上和右下第三磨牙的牙冠向遠中移動，使第二磨牙和第三磨牙的牙冠之間逐漸形成寬約0.8 mm的間隙，并改變了上下第三磨牙之間的咬合關系。空白對照組大鼠不做分牙處理（圖1）。

圖1 實驗性牙移動大鼠分牙模式圖Fig 1 The conceptual diagram of the experimental tooth-moving procedure

1.2 取材及切片制作

分牙后第1、3、7、14、21、24 d后（每個時間點n=4），戊巴比妥鈉腹腔注射全麻（0.1 g/ml），4%多聚甲醛固定液400 ml灌流內固定。取出雙側上下頜牙槽骨，置于4%多聚甲醛液中進行后固定24 h。

甲酸-甲酸鈉脫鈣液（4 mol/L甲酸和0.5 mol/L甲酸鈉）脫鈣2周。飽和碳酸鋰溶液中中和6～8 h。梯度乙醇序列脫水，浸蠟包埋，使牙齒長軸垂直于切面。石蠟切片機切片（厚度5μm）。

1.3 免疫熒光染色

常規脫蠟至水。復合消化液37℃孵育10 min，抗原修復液孵育30 min。正常山羊血清37℃下孵育30 min以封閉內源性結合位點。抗體孵育如下：①一抗：PGP 9.5一抗（1∶50，ab8189，Abcam，美國）進行單標或S-100（1∶100，ab14849，Abcam）與NT-3（1∶100，ab16640，Abcam）抗體混合液進行雙標，4℃孵育過夜，次日室溫復溫30 min；②二抗：FITC標記山羊抗小鼠二抗（1∶100，A0568，Beyotime，上海碧云天公司）進行單標或FITC標記山羊抗小鼠二抗和Cy3標記山羊抗兔二抗（1∶100，A0516，Beyotime）的混合液進行雙標，37℃溫箱孵育30 min。

1.4 封片，觀察

甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察（Olympus公司，FV1000，日本），觀察部位：移動牙（左側上頜第三磨牙）和移動牙的對頜牙（右側上頜第三磨牙）遠中根的根中下1/3（圖2），因為正常情況下此處為牙周神經末梢密度最大區域［1］。

圖2 觀察區域垂直向所在水平，即第三磨牙遠中根根中下1/3Fig 2 The observation area in the vertical direction，located at the apical and median third of the distal root of the third molar

1.5 統計學方法

應用SPSS 12.0統計軟件，單因素方差分析分別比較各時間點對照組和移動牙組，或對照組和移動牙的對頜牙組以下參數：①牙周神經末梢PGP 9.5陽性面積百分比；②終末雪旺細胞標記物S-100陽性面積百分比；③神經營養因子NT-3相對光密度。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 牙周膜內神經末梢標記物PGP 9.5免疫熒光染色結果

2.1.1 空白對照組 遠中根的PGP 9.5陽性信號主要分布在牙周膜腔的牙槽骨側，中間帶和牙齒側則很少（圖3）。

2.1.2 實驗組 在移動牙及移動牙的對頜牙，遠中根的PGP 9.5陽性信號分布較對照組更接近于牙齒側，PGP 9.5陽性面積百分比較對照組出現一過性減少，移動牙PGP 9.5陽性面積百分比最低值出現在牙移動后第3天，移動牙的對頜牙最低值出現在第14天，2組均于第24天恢復至基線水平（圖3）。

2.2 終末雪旺細胞標記物S-100和神經營養因子NT-3免疫熒光染色結果

在移動牙及移動牙的對頜牙，遠中根的終末雪旺細胞標記物S-100陽性面積百分比和神經營養因子NT-3相對光密度較對照組一過性地增多，移動牙的峰值出現在牙齒移動后第3天，移動牙的對頜牙峰值出現在牙齒移動第14天，2組均于第24天恢復至基線水平。免疫熒光雙標結果顯示NT-3與S-100的表達存在廣泛雙標，即存在廣泛共表達（圖4）。

圖3 牙周組織內PGP 9.5免疫熒光染色及統計結果 （×200）Fig 3 The immunofluorescent observation and quantitative analysis of PGP 9.5 immunoreactivity in the periodontal tissue（×200）

3 討 論

本研究發現，實驗性牙移動及其引起的咬合變化可引起移動牙及其對頜牙牙周神經末梢標記物PGP 9.5、終末雪旺細胞標記物S-100及神經營養因子NT-3在牙周膜內的表達及分布出現一過性的改變，與移動牙相比，移動牙的對頜牙的變化出現較晚，恢復更快。

咬合改變常可造成牙周神經末梢形態改變。后牙失咬合可引起牙周神經末梢顯微分布出現向牙周膜中間帶和牙齒側伸展的趨勢［4］。切牙失咬合可使切牙舌側牙周神經末梢在顯微結構上出現分枝減少等異常［10］。這些改變被認為是由于牙周膜缺乏生理性力刺激而造成的萎縮征象。在前牙反［5］和咬合升高［6］的動物模型中，牙周神經末梢的超微結構也會出現伸出長的突起等變化。正畸牙移動也會影響牙周膜的形態并使其表達多種生物因子，如MMP-13、MMP-9和IL-8等［11-13］，這些因子可能是本實驗中移動牙牙周神經末梢標記物PGP 9.5表達變化的原因。牙周神經末梢的顯微形態及分布是其功能基礎，因此本實驗觀察到的牙周神經末梢標記物PGP 9.5的一過性變化可能是臨床上移動牙齒感覺異常的原因。

牙周終末雪旺細胞對牙周膜內的神經末梢起著重要的支持、營養和功能輔助作用。終末雪旺細胞將牙周神經末梢包裹，并向周圍牙周纖維伸出舌狀突起，輔助牙周神經末梢的力信號傳導［8-9］。在神經受損后再生的過程中，終末雪旺細胞可改變其形態和分布，在神經再生的過程中起重要的引導和營養作用［14-15］。激活狀態的雪旺細胞可增加其神經營養子的表達［16-17］。在本實驗中，移動牙的牙周終末雪旺細胞標記物S-100的表達出現一過性增多，且其增多與PGP 9.5表達的降低同時發生。NT-3是外周感覺神經的重要神經營養因子。NT-3可參與皮膚力感受器的發育和功能發揮［18-19］。另外，NT-3還是雪旺細胞的自分泌因子，可支持成熟雪旺細胞的存活，從而促進神經再生［20-21］。本實驗牙周膜內NT-3的表達和S-100同時升高，且S-100與NT-3存在廣泛共表達。說明牙周膜內增多的NT-3主要由牙周雪旺細胞分泌，可能發揮了支持雪旺細胞存活的作用，從而在牙周神經末梢的改建和再生中發揮重要作用。除雪旺細胞外，神經元、角質細胞等也可表達NT-3［22-23］。在NT-3的峰值期（即移動牙的第3天和移動牙對頜牙的第14天），大多數NT-3均與S-100有共表達，但有少量NT-3并未與S-100雙標（圖4），說明有一部分NT-3并不來自于雪旺細胞，其來源有待進一步實驗闡明。

本實驗還發現，除了移動牙，移動牙的對頜牙牙周膜中PGP9.5、S-100和NT-3也出現一過性的變化。說明因正畸皮圈的彈力移動了受力牙，使其與移動牙的對頜牙出現尖窩關系的改變，從而使移動牙的對頜牙的牙周膜也承受了異常的咬合力。然而這些變化較移動牙出現晚且恢復快，說明這種咬合改變引起的牙周組織改建發生較緩和。

圖4 牙周組織內S-100和NT-3免疫熒光雙標染色及統計結果 （×200）Fig 4 The immunofluorescent observation and quantitative analysis of S-100 and NT-3 immunoreactivity in the periodontal ligament（×200）

4 結 論

實驗性牙移動及其引起的異常咬合力可引起牙周神經末梢標記物的一過性改變，終末雪旺細胞及其表達的NT-3可能在其中起著積極作用。