快速降解的彈性體（PGS/PCL）人工血管重建肌性功能性頸動脈的實驗研究

2019-10-16 06:38:46楊欣楊帆郭曉寶吳煒高瞻

實用口腔醫學雜志 2019年5期

楊欣楊帆郭曉寶吳煒高瞻

由于頸動脈功能和位置的特殊性，頸動脈被腫瘤侵犯后，給手術治療術式的選擇帶來很大的挑戰［1-3］。連同被侵犯的頸動脈與腫瘤整體切除的術式是業界比較認可的可以減少復發率提高生存率的方式，但是頸動脈切除后，如果不重建頸動脈血流，會有不小的造成的神經系統并發癥的機率。而頸動脈結扎切除后重建頸動脈可以有效減少神經系統并發癥的發生［4-6］。

目前，頸動脈重建常用到的方法有自體靜脈移植（大隱靜脈、股淺靜脈等）以及不可降解的惰性材料構建的成品人工血管等。但均存在不同的缺陷［7-8］。

應用聚癸二酸丙三醇酯［poly（glycerol sebacate），PGS］為主體構建了雙層人工血管，PGS屬于一種彈性體，其彈性模量與動脈接近。本實驗研究旨在評估這種雙層人工血管重建頸動脈的效果，為頸動脈的重建提供一種更優的選擇。

1 材料與方法

1.1 PGS/PCL雙層人工血管的構建

PGS/PCL雙層人工血管的構建與之前實驗描述過的一樣，利用模具構建鹽（NaCl）模，淋濾PGS溶液，真空干燥箱中加熱使PGS交聯。利用靜電紡絲技術將聚乙酸內酯（PCL，polycaprolactone）納米纖維絲纏繞在鹽模上，將鹽模復合體浸入去離子水，去凈其中的鹽。構建好PGS/PCL雙層人工血管，儲存在常溫干燥箱中，使用前環氧乙烷消毒消毒。

1.2 PGS/PCL雙層人工血管物理特性的分析

掃描電鏡（SME）檢測，修剪標本，噴金處理，掃描電鏡（日立，S-4800，日本）觀察并且拍照片，管壁的厚度以及鞘層的厚度用掃描電鏡自帶的測量軟件進行測量和記錄。彈性模量、拉伸強度和縫合強度的測量使用微小力拉扭試驗機（BOSE，Electroforce 3200 seriesⅡ，美國）來測試。PGS/PCL人工血管截成大約2 mm小段，安裝到機器上，給予單向徑向的拉力，速度為2 mm/min，最大加力為10 N。縫合強度的測量，將9-0的顯微外科縫線從距PGS/PCL人工血管管口大約1 mm處穿出后打結，安裝到機器上，加力方式、強度和速率同前。

1.3 PGS/PCL人工血管手術植入大鼠頸動脈

雄性SD大鼠10只，體重大約250～300 g，使用小動物麻醉機，對大鼠行異氟醚吸入麻醉（5%誘導麻醉，2%維持麻醉），麻醉滿意后，在頸部正中切口暴露頸總動脈，分離，血管夾兩頭夾住頸動脈，切除大約5 mm頸動脈，顯微外科方法吻合人工血管與頸動脈兩端。術后未給予抗凝和抗血小板治療。12個月后，麻醉下（方法同前），分離并切取新生血管后，進一步完成組織學，生物化學、掃描電鏡、機械力學等的分析。

1.4 血管造影（CTA）

按照45 mg/kg的劑量，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，尾靜脈注射碘比醇（三代顯，法國加柏公司，50 ml）3 ml，GE Brightspeed 8排CT掃描大鼠全身，用其自帶軟件行三維成像重建。

1.5 新生血管的組織學分析

標本用PBS漂洗后，OCT包埋劑包埋，冰凍切片機（萊卡生物，德國）切片厚度為5μm。4%的多聚甲醛中固定5 min后，分別行HE，馬松三色和偉郝夫范吉森染色，在正置顯微鏡（尼康551，日本）下觀察并拍照片。掃描電鏡分析的標本，PBS漂洗后，2.5%的戊二醛溶液過夜固定，乙醇濃度梯度脫水的方法脫水，碳纖維膠帶黏貼到到掃描電鏡專用的鋁托上，噴金處理后，用掃描電鏡觀察并且拍照片。

1.6 免疫熒光染色

α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達，選擇小鼠抗大鼠SMA單克隆抗體作為一抗；平滑肌肌球蛋白重鏈（MHC）的表達，選擇小鼠抗大鼠MHC單克隆抗體作為一抗；彈性蛋白和膠原蛋白的表達，選擇兔抗大鼠彈性蛋白多克隆抗體，和兔抗大鼠膠原I和膠原III多克隆抗體作為一抗。熒光二抗分別選擇山羊抗兔Alexa Fluor 488抗體（Jackson，USA）和山羊抗小鼠Alexa Fluor 488抗體，以及山羊抗兔Alexa Fluor594山羊抗小鼠Alexa Fluor 594抗體。未使用一抗的切片作為陰性對照，大鼠自體頸動脈作為正常對照組。

1.7 生物化學定量分析（彈性蛋白、膠原蛋白、DNA）

彈性蛋白的定量分析使用了Biocolor彈性蛋白檢測試劑盒（Biocolor，F2000，UK）。依照產品說明操作步驟，提取出可溶性的彈性蛋白，將管內液體轉移到96孔板上，放入酶標儀，繪制出標準曲線，比對后得出樣本中彈性蛋白的含量。膠原蛋白的定量分析使用了Biocolor膠原蛋白檢測試劑盒（biocolor，S1000，UK）。依照產品說明操作步驟，逐步將標本中的膠原蛋白提取出后，與染料結合，后根據染料的量比對出標本中所含有的膠原蛋白的量。DNA的提取使用德國QIAGEN的DNA提取試劑盒，依照試劑盒詳述的操作步驟提取出標本中的DNA后，比對出DNA的含量。

1.8 統計學分析

所有數據均使用±s來表示，采用雙尾t檢驗來比較差異。P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 PGS/PCL人工血管的微觀結構和機械力學性能

PGS/PCL人工血管具有雙層結構（圖1A），內層為相互連通的多孔狀的PGS管芯（圖1B），外層為菲薄的PCL納米纖維鞘層結構（圖1C）。PGS/PCL人工血管在對折180°后不會出現扭結的現象（圖1D）。菲薄的（12.27±0.79）μm PCL納米纖維鞘層將彈性模量從（153.47±71.80）kPa提高到（415.31 ±37.41）kPa（圖1G），抗拉強度從（110.67±14.35）kPa提高到（1 162.42±34.13）kPa（圖1F）。很大地提高了臨床使用的安全性。PGS/PCL人工血管的縫合強度（0.43±0.065）N顯著大于PGS管芯（0.12±0.017）N、靜脈血管（0.25±0.041）N以及9-0的顯微外科縫線（0.26±0.014）N的縫合抵抗力（圖1E）。

2.2 PGS/PCL人工血管在體內的改建

人工血管在動脈血流的高壓下，迅速變紅，PCL納米纖維鞘層迅速有效地阻止了血液的持續滲出，管壁未見明顯膨脹（圖2A）。12個月后，CTA和尸檢分析其通暢率為90%，未發現管腔狹窄以及動脈瘤（圖2B）。

新生血管的彈性模量和斷裂強度分別是（122.92±47.12）kPa和（50.86±7.14）kPa，顯著大于靜脈的彈性模量和斷裂強度。而更加接近自體頸動脈的彈性模量（361.09±93.02）kPa和斷裂強度（79.71±6.12）kPa（圖2C～D）。

圖1 PGS/PCL人工血管的微觀結構和機械力學性能Fig 1 The microstructure and machinery mechanics of the PGS/PCL artificial vessel

圖2 PGS/PCL人工血管植入大鼠頸動脈后觀察Fig 2 Observation of the PGS/PCL artificial vessel after transplantation in carotid artery of rats

2.3 PGS/PCL人工血管在體內改建成了幾乎完全細胞化的肌性血管

HE染色可以發現，12個月后，PGS/PCL人工血管已經幾乎完全發生了細胞化的改建，可見及細胞外基質整齊地沿圓周方向排列，形成了與自體血管類似的三層管壁結構，即內皮細胞層，平滑肌層以及疏松的外膜層（圖3 A、D）。新生血管DNA含量（2.36±0.35）μg/mg與自體血管的DNA含量（2.57±0.26）μg/mg沒有統計學差異（n=5，P＞0.05）（圖4I）。

α-SMA和MHC是平滑肌細胞的標記性蛋白，免疫熒光染色發現新生血管中膜層分布著大量的SMA和MHC陽性表現的平滑肌細胞整齊地沿著圓周方向排列著（圖3B～C、E～F）。

新生血管的SEM影像證實管腔內層覆蓋有一層平滑完整的內皮細胞層，其上未發現明顯的血小板聚集和血栓形成（圖3H～I）。在新生血管與自體血管的連接處覆蓋有一層平滑連續的內皮細胞，連接處有縫線作為標記（圖3G）。

圖3 移植后12個月PGS/PCL人工血管的大鼠體內改建Fig 3 Remodeling of the PGS/PCL artificial vessel 12 months after transplantation

2.4 新生血管沉積了適量的功能性細胞外基質

免疫熒光染色提示新生血管里彈性蛋白的高表達，且按照圓周方向排列（圖4C、F）。定量分析說明新生血管中彈性蛋白含量（10.06±1.92）μg/mg高于自體靜脈血管中彈性蛋白的含量（5.72±0.76）μg/mg，新生血管彈性蛋白的含量接近自體動脈彈性蛋白的含量（13.51±1.18）μg/mg，但仍有統計學差異（圖4H）。免疫熒光染色提示了新生血管中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達強度和排列方式均類似于自體動脈（圖4A～B、D～E）。膠原蛋白定量分析示新生血管中膠原蛋白的含量（51.76±7.21）μg/mg與自體動脈血管中膠原蛋白的含量（58.73±3.24）μg/mg以及自體靜脈血管中膠原蛋白的含量（55.34±5.42）μg/mg無統計學差異（圖4G）。

3 討論

目前臨床上常用于血管置換的自體血管和成品人工血管的所存在的局限性，影響并限制著頸動脈等一些血管移植手術的開展［12］。而無細胞植入的組織工程多數集中在慢降解的高分子聚合物材料的研究上［13-16］。而材料的長期殘留會因為反生纖維包裹而是組織變硬鈣化，另外也會激活炎性細胞而引起內膜的增生［17］。而本研究使用了快速降解的PGS彈性體作為主體材料構建成人工血管，另外外層輔以一層菲薄的PCL納米纖維材料來增強機械力學強度，植入體內后隨著PGS的快速降解為募集細胞的分化和生長增殖提供了相應的空間，而細胞的增殖和細胞外基質的分泌又可以彌補PGS降解所損傷的機械力學強度。

PCL屬于慢降解材料，納米纖維材料在體內至少保留1年以上［10］，這為募集細胞的分化生長提供了穩定的力學環境。因為頸動脈位于頸部，其活動方式及活動度的特殊性，以及頸動脈血流速度相對于腹主動脈慢，因此替換頸動脈的血管移植體在血流速度相對較慢的情況下，需要承受更多的拉升扭曲等特殊情況下對于其通暢率的及細胞化的考驗。如前述的結果表明PGS/PCL人工血管可以實現頸動脈的肌性功能性的重建，在體內可以改建成為大體結構和組織學方面均與自體頸動脈相似的動脈血管，具有臨床應用前景。