酪蛋白磷酸鈣復合體對乳牙脫礦釉質再礦化作用的體外實驗研究

趙巖 高平

齲病是常見兒童口腔疾病之一。乳牙齲病不僅影響患兒的咀嚼功能和面部美觀，更重要的是影響牙弓和頜骨的發育。在齲病的防治中，早期未形成齲洞時可以采用再礦化療法進行治療，使脫礦釉質再礦化，阻止齲病進一步惡化，從而恢復牙體形態。因此，對乳牙早期齲病的控制顯得十分重要。

針對釉質脫礦通常可采用再礦化治療，最為典型的防齲制劑是氟化物，包括氟化物溶液、含氟牙膏、含氟涂料等［1］。但氟制劑存在潛在的毒副作用和誘使耐氟菌株的產生等弊端［2］，這些都限制了氟化物防齲的臨床應用。因此，尋找新的安全有效的生物防齲制劑勢在必行。以酪蛋白磷酸鈣復合體（CPP-ACP）為主要成分的再礦化制劑，具有致敏性小、無細胞毒性、食用安全的優點。動物及人原位齲病模型研究和體外實驗均已證實CPP-ACP有抗齲性［3］。為此，本研究選擇CPP-ACP進行實驗，用Micro-CT掃描和三維重建軟件檢測標本，通過對乳牙牙齒脫礦區域體積進行量化分析及長期觀察，初步探討CPP-ACP對乳牙牙齒釉質的再礦化能力，為乳牙早期釉質齲病的再礦化治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 樣本

選擇不同個體的乳牙20顆，肉眼觀察牙體表面光滑、平整、且無裂紋、無著色及無缺損。將實驗牙用拋光輪在流水下對唇面釉質依次拋光，在離體牙標本頰面留出約2 mm×2 mm開窗區，開窗區四角各鉆直徑0.3 mm圓形凹陷用于定位，其余牙體部分用抗酸性指甲油封閉。標本用350 ml/L的乙醇浸泡24 h，清水沖洗后放在0.9%生理鹽水中4℃冰箱保存，每日更換生理鹽水，保存期不超過30 d。

1.2 材料與儀器

1.2.1 材料 CPP-ACP（GC，日本），NaF（3M，美國），人工致齲液［4］：硝酸鈣2.2 mmol/L，磷酸二氫鉀2.2 mmol/L，醋酸50 mmol/L，氟化鈉0.1 mmol/L，用5 mol/L KOH調至pH為4.5。人工唾液：NaCl 0.4 g，KCl 0.4 g，CaCl2·2H2O 0.795 g，NaH2PO4·2H2O 0.78 g，Na2S·2H2O 0.005 g，脲素1.0 g，蒸餾水稀釋至1 000 ml，使其pH值為6.8。

1.2.2 實驗儀器 Micro-CT（SkyScan 1174型，Bruker公司，比利時），電子恒溫水浴箱（上海醫療器械廠）。

1.3 方法

將試件完全浸泡于5 ml人工致齲液中，放入37℃恒溫水浴箱中96 h，每12 h更換1次人工致齲液。樣本釉質脫礦區制備完成后，隨機分為4組，每組均為5個樣本，即A組：去離子水，B組：0.2%氟化鈉，C組：10%CPP-ACP，D 組：0.2%氟化鈉 +10%CPPACP。

各組樣本分別用去離子水、NaF、CPP-ACP、NaF+CPP-ACP涂布牙面5 min，自然晾干，每天的9：00和18：00各1次。間隔期浸泡于人工唾液中，每24 h更換1次人工唾液。實驗持續28 d，在乳牙脫礦前和再礦化第0天，第14天和第28天進行Micro-CT掃描。

采用Micro-CT掃描標本，樣本放在轉臺上，X射線束垂直于牙齒的頰面，掃描條件：電壓100 kV，電流100μA，像素分辨率0.03 mm，整合時間1 200 ms，共獲得276張斷層影像，掃描時間為55～60 min。利用CTan分析軟件讀取TIFF格式數據，首先選用局部閾值法，根據正常牙體組織和釉質脫礦區的灰度值的差異，得到釉質脫礦區的二值化圖像（圖1），然后選擇體積（mm3）參數，測量乳牙釉質脫礦區的體積變化。

圖1 Micro-CT斷層圖像Fig 1 Micro-CT images of the tooth samples

1.4 統計學處理

使用SPSS 18.0統計軟件對實驗數據行單因素方差分析和LSD-t檢驗。所有數據均以±s表示，以P＜0.05為差異具有顯著性。

2 結 果

各實驗組不同礦化時間的脫礦區體積測量結果見表1。

表1 各實驗組不同礦化時間的脫礦區體積變化（n=5，±s）Tab 1 The volume of the demineralization at different times（n=5，±s）

表1 各實驗組不同礦化時間的脫礦區體積變化（n=5，±s）Tab 1 The volume of the demineralization at different times（n=5，±s）

注：①與A組比較，P＜0.05；②與B、C組比較，P＜0.05

組別 體積（mm3）再礦化后0 d 再礦化后2周 再礦化4周0.52±0.20 0.51±0.15 0.53±0.19 B組 0.55±0.18 0.56±0.20① 0.55±0.20①C組 0.57±0.15 0.54±0.11① 0.51±0.11①D組 0.58±0.19 0.53±0.12①②0.49±0.16 A組①②

采用單因素方差分析對4組數據進行總體分析，結果顯示：同一時間4個實驗組的脫礦區體積不相同，差異有統計學意義（P＜0.05）。

采用LSD-t檢驗進行組間兩兩比較。結果顯示：A組與B、C、D組、B組與D組及C組與D組間脫礦區體積的差異有統計學意義（P＜0.05），其余各組間的差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討 論

依據第3次全國口腔健康流行病學調查數據，5歲年齡組兒童乳牙齲病的患病率為66.0%，12歲年齡組兒童恒牙齲病的患病率為28.9%［5］。因此，預防齲病，降低齲病發病率，對提高人群的健康水平和生活質量都具有重要意義。有學者發現牙釉質表層的脫礦和再礦化是一個持續的過程。早期釉質齲損如及時采取再礦化措施則可阻止齲損的進展，避免齲洞形成。因此許多研究采用多種方法促進釉質表面的再礦化，從而使早期齲達到不同程度的控制，來阻止齲病的發生［6］。長期以來氟化物是釉質再礦化的主要制劑［7-8］，但由于地方區域性特點，應用氟化物防齲，使用的氟濃度差異很大，同時過量使用氟化物會導致氟中毒和氟牙癥，還會誘使耐氟菌株的產生等，這些不足之處都限制了氟化物在乳牙早期釉質齲的臨床應用。近年來學者們發現CPP-ACP抑制牙釉質脫礦并促進早期光滑面齲再礦化的作用。張曉潔等［9］用顯微硬度計來評價CPP-ACP對牙釉質脫礦區的再礦化情況，結果顯示實驗組牙釉質顯微硬度高于陰性對照組，證明CPP-ACP在體外實驗中能促進牛釉質再礦化。

目前釉質礦和再礦化的檢測方法的研究方法主要有：X射線顯微照相術、顯微硬度測定、共聚焦激光掃描顯微鏡檢測法、原子光譜測定法等［10］。以上研究方法均需破壞樣本，這就容易丟失牙體組織信息，而且無法對同一樣本進行連續觀察，造成測量結果誤差較大。隨著醫學影像技術及計算機圖像處理技術的進步，Micro-CT和三維重建技術在骨科學、口腔科學、骨替代材料等領域的應用日趨廣泛。它具有定位準確、無創傷、無間隔、可重復、分辨率高，較高的可靠性等優點。Micro-CT擁有極強的圖像分辨率和強大的圖像處理軟件，在不破壞標本的前提下可以連續觀察和定量計算樣本內部感興趣區的體積、面積、孔隙率等指標。Hamba等［11］應用Micro-CT和橫斷顯微照相技術（TMR）測量牙釉質的脫礦深度和礦物質密度，結果發現兩者之間具有相關性，表明Micro-CT可以替代橫斷顯微照相技術進行釉質脫礦的研究。其它研究結果說明Micro-CT是評價釉質礦化程度的有效方法［12-13］。為此，本研究通過Micro-CT掃描和三維重建軟件檢測標本，測量乳牙釉質脫礦區體積的變化情況，來評價CPP-ACP再礦化效能。

本實驗應用Micro-CT掃描和三維重建軟件，定量研究乳牙釉質脫礦區的體積，用體積參數評價CPPACP再礦化效能，排除了人為因素的干擾，減少了主觀的偏倚。本研究發現，再礦化2周及4周時，10%CPP-ACP組和0.2%氟化鈉組的脫礦區體積顯著低于于去離子水對照組。此結果表明，CPP-ACP有促進脫礦釉質再礦化的能力，其作用與0.2% NaF組相似。這與龍寶軍等［14］學者的實驗結論相一致。其作用機制可能是：CPP-ACP可提高牙表面的鈣磷質量濃度，減緩游離鈣的擴散，在牙表面形成一個鈣離子庫，阻止不溶性磷酸鈣的形成，從而減少釉質的脫礦并為再礦化提供鈣源。本實驗顯示，再礦化2周及4周時，0.2%氟化鈉+10%CPP-ACP組的脫礦區體積顯著低于10%CPP-ACP組和0.2%氟化鈉組。其結果說明：NaF和CPP-ACP聯合后的再礦化能力顯著高于其他組。NaF與CPP-ACP聯合使用可以促進恒牙再礦化已得到許多研究的證實［15-16］。其作用機制可能是氟離子存在于CPP-ACP溶液中時，氟離子被吸附進入了CPP結合的ACP相，形成了一種新型的非結晶型磷酸氟鈣相（ACFP）。ACFP溶液中的氟離子活性增強，更具有滲透力，能夠進入齲損深層，促進再礦化時晶體的生長。

總之，本實驗研究表明NaF和CPP-ACP均能促進脫礦乳牙牙釉質再礦化，兩者聯合使用則效果更佳。此外采用Micro-CT測定脫礦區體積來評價乳牙礦化和再礦化的效果，為研究提供了一個有價值的方法。當然本實驗無法完全模擬臨床情況，接下來的實驗中會進一步深入研究。