microRNA-21、Caspase-3、Caspase-9在舌鱗狀細胞癌中的表達水平

陳筱雪 孫斌 黎昌學

口腔舌癌是口腔頜面部常見惡性腫瘤，其進展中發生多種信號通路的異常激活，且98%以上的舌癌為鱗狀細胞癌［1］。通過舌鱗癌組織中蛋白質組學分析，搜索腫瘤相關蛋白，可了解癌癥的分子發病機制外，還可能作為生物標志物具有潛在的臨床應用，能夠在高風險個體的早期階段識別腫瘤，預測治療反應，殘留或復發癌治療后盡早發現。促癌基因microRNA-21作為多種腫瘤中典型的代表，位于染色體17 p 23.2的脆性位點，其過量表達會誘導腫瘤的進展，并特異性地作用靶向基因，在細胞凋亡中起著不可替代的作用［2］。宋剛等［3］、蔣麗等［4］及劉濤等［5］研究認為microRNA-21參與大腸癌、結腸癌與食管癌等多種腫瘤的進展，并有可能通過影響相關線粒體凋亡通路的表達而發揮作用。本實驗擬通過檢測舌癌旁組織及舌鱗狀細胞癌組織中microRNA-21以及線粒體凋亡通路相關基因Caspase-3、Caspase-9的表達情況，初步明確其在舌鱗狀細胞癌中表達的相關意義，為臨床舌癌提供相關參考資料。

1 資料與方法

1.1 標本采集

選取2016-01～2018-08在新疆石河子大學第一附屬醫院及新疆維吾爾自治區人民醫院舌鱗狀細胞癌患者33例。納入標準：①經病理科診斷明確者［6］；②臨床腫瘤分期明確，均未經任何放化療治療者；③所有組織標本去除出血、壞死及電灼組織者；④臨床資料完整者，所以患者均收集其舌癌組織和癌旁正常組織，各33例；⑥入選患者均獲得知情同意。其中男性21例，女性12例；年齡36～77歲，平均（61.22±4.38）歲；高分化舌鱗癌15例、中分化舌鱗癌10例，低分化舌鱗癌8例；有頸淋巴結轉移13例，無頸淋巴結轉移20例。

1.2 熒光實時定量PCR（qRT-PCR）檢測方法

利用昆泰銳（新疆）生物公司合成引物，將U6為內參照物，采用SYBR Green法定量檢測以下mRNA表達水平。收集新鮮組織置于離心管中，總RNA提取及RT-qPCR反應體系均嚴格按試劑盒說明書進行，數據由軟件自動提供。PrimerPmmier 5軟件設計合成引物如下：U6引物序列，上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'，NM-138085.1，全長為102 nt，擴增產物為27 bp；Caspase-3引物序列，上游5'-AGACCATACATGGGAGCAAG-3'，下 游 5'-GTCCACATCCGTACCAGAGC-3'， NM-009810.3，全長為176 nt，擴增產物為23 bp；Caspase-9引物序列，上游5'-GTGAACTTCTGCCCTTCCTCG-3'，下 游 5'-CCATCAAAGCGTGACCATTT-3'， BC-056447.1，全長為182 nt，擴增產物為23 bp；microRNA-21引物序列，上 游 5'-CTTCAGGGGCAATGAGACGAC-3'，下 游 5'-GCACATTGGGGATGAACAGC-3'，NM-001329396.1，全長為105 nt，擴增產物為21 bp。取逆轉錄產物于Real-time PCR儀上進行擴增并檢測熒光。20μl實時定量PCR反應體系如下：SYBR Green Master（ROX）10μl，上游引物（5μmol/L）0.4μl，下游引物（15μmol/L）0.5μl，cDNA 2μl，用DEPC處理水補齊20μl。PCR反應條件：94℃預變性10 min，活化Tag DNA polymerase酶0.2μl、H2O 7.4μl；具體反應條件為：變性95℃180 s，退火、延伸95℃12 s，62℃50 s，共循環40次所有反應均設復孔3個，以減少加樣等造成的誤差影響實驗結果，記錄每個反應管中的熒光信號到達設定的閡值時所歷經的循環數即CT值，按照2-ΔΔCT法統計定量分析以上miRNA21與內參平均吸光度值，以兩者吸光度比值作為目的基因相對表達量。

1.3 統計學方法

采用SPSS16.0進行數據統計學分析，計量資料±s表示，以內參基因U6作為參照，舌鱗狀細胞癌與癌旁正常組織的相對表達結果，以及與舌鱗癌各臨床病理參數的關系采用配對t檢驗，并采用Pearson相關系數分析microRNA21與Caspase-3、Caspase-9間是否存在相關性。P＜0.05有統計學意義。

2 結 果

2.1 qRT-PCR 檢測microRNA-21 RNA、Caspase-3 RNA、Caspase-9 RNA在舌鱗狀細胞癌組織中的表達

舌鱗狀細胞癌中microRNA-21 mRNA的相對表達量明顯高于癌旁正常組織（P＜0.05），而Caspase-3、Caspase-9的相對表達量明顯低于癌旁正常組織（P＜0.05）（表1）。

表1 qRT-PCR檢測microRNA-21 RNA、Caspase-3 RNA、Caspase-9 RNA在舌鱗狀細胞癌組織中的表達情況分析Tab 1 Analysis of microRNA-21 RNA，Caspase-3 RNA and Caspase-9 RNA expression in tongue squamous cell carcinoma by qRT-PCR

2.2 microRNA-21 RNA、Caspase-3 RNA、Caspase-9 RNA表達與舌鱗癌各臨床病理參數的關系

microRNA-21 RNA、Caspase-3 RNA、Caspase-9 RNA表達均與患者的性別（男/女）、年齡（≤60歲）比較無明顯統計學意義（P＞0.05）；但與組織分化、頸淋巴結轉移有明顯統計學意義（P＜0.05），其中低分化與有頸淋巴結轉移組織的microRNA-21 RNA表達明顯高于高分化與無頸淋巴結轉移組織（P＜0.05），而低分化與有頸淋巴結轉移組織的Caspase-3 RNA、Caspase-9 RNA表達明顯低于高分化與無頸淋巴結轉移組織（P＜0.05）（表2）。

2.3 microRNA-21 RNA、Caspase-3 RNA、Caspase-9 RNA在舌鱗狀細胞癌組織中表達的相關性分析

在舌鱗狀細胞癌組織中，microRNA-21 與Caspase-3表達呈顯著負相關（r=-0.598，P＜0.001），microRNA-21與Caspase-9表達呈顯著負相關（r=-0.652，P＜0.001）。

表2 microRNA-21 RNA、Caspase-3 RNA、Caspase-9 RNA表達陽性率與舌鱗癌各臨床病理參數的關系 ［n（%）］Tab 2 Relationship between microRNA-21 RNA，Caspase-3 RNA，Caspase-9 RNA expression and clinical pathological parameters of tongue squamous cell carcinoma ［n（%）］

表3 microRNA-21 RNA、Caspase-3 RNA、Caspase-9 RNA在舌鱗狀細胞癌組織中表達的相關性分析Tab 3 Correlation analysis of microRNA-21 RNA with Caspase-3 RNA or Caspase-9 RNA expression in tongue squamous cell carcinoma

3 討 論

頭頸部/口腔鱗狀細胞癌是多種多樣的癌癥，在各種器官中發生的復雜疾病，包括口腔，舌，咽和喉，其從許多不同的解剖部位發展并且與不同的風險因子和遺傳特征相關，來自這些不同部位的腫瘤具有不同的臨床表現和臨床結果，并且與不同的風險因素和遺傳特征相關［7］。舌鱗狀細胞癌是最常見的口腔部位之一，其發病率實際上在年輕和中年人群中增加。就局部入侵和傳播而言，舌鱗狀細胞癌比其他形式的頭頸部/口腔鱗狀細胞癌明顯更具攻擊性，具有快速局部侵襲和擴散的傾向［8-9］。癌細胞具有遺傳改變，其被轉化為獨特的表達模式，這些模式可以將癌細胞與相同來源的正常組織分離，并用作分子生物標志物［10］。此外，表達模式變化可能比臨床疾病檢測早得多。這些模式的鑒定對于早期檢測和診斷以及鑒定新的治療靶標具有顯著的指導價值。

microRNA-21的靶基因PTEN可以抑制P13K/Akt信號轉導途徑的功能，而活化的Akt通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Caspase-9表達等，調控細胞的增殖、分化、凋亡［11-12］。早年研究顯示，敲低microRNA-21后可以抑制Tb3.1人舌癌細胞增殖與侵襲能力，提示microRNA-21可能是促進舌鱗狀細胞癌發生的因子［13］。microRNA-21可使Bcl-2表達上升，Bcl-2可介導線粒體外膜來釋放細胞色素C，激活Caspase-3，啟動Caspase級聯反應［14］。本實驗擬檢測舌癌旁組織及舌鱗狀細胞癌組織中microRNA-21以及線粒體凋亡通路相關基因Caspase-3、Caspase-9的表達情況，及其表達率與舌鱗癌各臨床病理參數的關系。近年來研究發現，致癌基因miRNA21過量表達會促進腫瘤的進展，并特異性地作用于癌基因、抑癌基因，如癌基因Bcl-2、Serpinil、RhoB等，腫瘤抑制基因PTEN、RECK和hMSH2等，最終調節轉錄后水平基因的表達，影響細胞的增殖凋亡等［15-16］。細胞增殖和分化及凋亡異常會導致腫瘤的發生，激活或啟動自身內一系列特殊蛋白基因程序，如Caspase家族蛋白參與了細胞凋亡過程。Caspase中包含的凋亡啟動因子中的Caspase-9在發生自我活化后，可激活下游的Caspase；而凋亡執行因子中的Caspase-3可導致細胞凋亡，是主要的效應因子［17］。細胞凋亡其中一條途徑是線粒體凋亡通路，通過活化凋亡效應蛋白Caspase 3、6、7、9及PPAR，最終使DNA斷裂細胞凋亡，故這些效應蛋白Caspases在細胞凋亡的過程中發揮關鍵作用［18］。

龐文彪等［19］研究在中國地鼠口腔黏膜癌變過程中，發現鱗癌組織中Caspase-3、Caspase-9表達明顯降低，但隨著增生程度的加重，Caspase-3、Caspase-9表達明顯降低，揭示了Caspase-3、Caspase-9表達與口腔鱗癌的發生、發展密切相關。顧小軍等［20］研究結果表明口腔鱗癌患者唾液上清液中microRNA-21的表達上調，可能與口腔鱗癌的發生發展有關。故本研究推測MicroRNA-21在舌鱗狀細胞癌的發病中起重要作用，其可能通過影響線粒體凋亡通路相關基因Caspase-3、Caspase-9的表達，從而抑制了凋亡的發生，導致了舌鱗狀細胞癌的發生、發展。本研究結果發現，舌鱗狀細胞癌中microRNA-21 mRNA的相對表達量明顯高于癌旁正常組織，而Caspase-3、Caspase-9的相對表達量明顯低于癌旁正常組織，結果與Giovannetti等［16］、顧小軍等［20］的報道一致。而Caspase-3、Caspase-9的表達下降，且與miRNA21表達水平呈負相關，該結果提示舌鱗狀細胞癌組織的發生發展過程中高表達的miRNA21通過抑制細胞凋亡而促進細胞的轉化和增殖，而其抑制凋亡可能是通過直接或間接抑制Caspase-3、Caspase-9活性達到的［7，16，20］，這表明miRNA21的高表達和Caspase-3、Caspase-9的低表達可能共同參與了舌癌 的發病過程，并 且 miRNA21 對 Caspase-3、Caspase-9凋亡通道可能存在負反饋機制。而本研究進一步結果證實舌鱗狀細胞癌中microRNA-21與Caspase-3、Caspase-9表達呈顯著負相關。最后，本研究還表明microRNA-21 RNA、Caspase-3 RNA、Caspase-9 RNA表達均與患者的性別、年齡（≤60歲）比較無差異；但與組織分化、頸淋巴結轉移有差異，其中低分化與有頸淋巴結轉移組織的microRNA-21 RNA表達明顯高于高分化與無頸淋巴結轉移組織，而低分化與有頸淋巴結轉移組織的Caspase-3 RNA、Caspase-9 RNA表達明顯低于高分化與無頸淋巴結轉移組織。目前，已有針對miRNA21的靶向治療［21］（目前針對micRNA21常見的抑制劑包括anti-microRNA寡核苷酸（anti-microRNA oligonucleotide，AMOs）、鎖 核 酸（Locked nucleic acid，LNA）、microRNA小分子抑制劑等）與其他促凋亡治療結合，協同治療腫瘤的多項研究；增加Caspase-3、Caspase-9表達，和/或抑制miRNA21在腫瘤組織中的表達，可能將在抗腫瘤治療中具有重要價值。

綜上所述，microRNA-21、Caspase-3、Caspase-9可能參與舌鱗狀細胞癌的形成，miRNA-21可能通過調節Caspase-3，Caspase-9線粒體凋亡通道來影響舌鱗狀細胞癌的發生發展。而對3種基因之間相互作用機制的進一步研究，可能會給舌鱗狀細胞癌的診治帶來新的理論依據。本研究有待后期進行細胞學和實驗動物相關研究，進一步驗證靶向基因治療的可行性。