MiR-126影響口腔鱗癌細胞增殖和遷移的研究

李玉梅 楊波 劉秦川

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是世界范圍內常見的人類惡性腫瘤之一，并且近年來其發病率呈現上升趨勢。據統計，每年因口腔鱗癌而死亡的人數超過400 000人，其中80%的死亡人口來自發展中國家［1］。隨著對口腔鱗癌研究的深入，目前的觀點認為口腔鱗癌是由致癌物引發的一個多因素、多步驟的復雜生物學過程，其中癌癥相關基因的改變在這一過程中具有重要作用。研究者普遍認為癌癥相關的基因變化來自于遺傳信息的丟失、突變或過表達［2］。microRNAs（miRNA）是一類長度約為22nt的非編碼RNA，通常在轉錄后水平調控靶基因表達［3］。許多miRNA參與了重要的生物學過程，例如細胞分化以及上皮細胞向間充質細胞轉化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）等。目前的研究發現在許多腫瘤組織中，均發生了miRNA的含量改變［4］。但目前對于口腔鱗狀細胞癌與miRNA表達改變的報道較少，目前已經發現了一些與口腔鱗癌的發生和發展存在一定聯系的miRNA，其中包括miR-34b，miR-100，miR-125b miR-137，miR-193a和miR-203等。與正常口腔黏膜組織相比，這些miRNA的表達含量在口腔鱗癌中發生特異性的改變［5］。此外，多項研究證明miR-126的含量在結腸癌、胃癌以及惡性血液腫瘤中發生了顯著改變［6-8］。但是miR-126是否參與了口腔鱗癌細胞的生物學功能過程，目前尚未有文獻報道。本研究檢測miR-126在口腔鱗癌以及正常口腔黏膜組織中的表達水平差異，并改變口腔鱗癌細胞中miR-126的表達水平來觀察其在增值、遷移方面的變化，進而探究miR-126在口腔鱗癌中可能的作用并為臨床診療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

自2010-08～2017-06共收集于漢川市人民醫院口腔科確診的18例口腔鱗癌患者的鱗癌標本及周邊非癌變口腔黏膜組織，所有收集標本均經病理檢查明確診斷及腫瘤細胞惡性程度判定。8例正常口腔黏膜標本來自正常成年志愿者。詳細記錄納入標本提供者的年齡、性別、吸煙史等資料。本研究經過倫理委員會批準，所有標本提供者均簽署知情同意書。口腔鱗狀細胞癌細胞系（SCC-4，SCC-9和SCC-15）購于上海中科院細胞庫。

1.2 實驗試劑

DMEM/F12完全培養基、Trizol提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、Lipofectatmine 3000、PIK3R1抗體（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；MTT細胞活力檢測試劑（Sigma公司，美國）；Matrigel基質膠（BD公司，美國）；miR-126 agomir、miR-126 antagomir及陰性對照（negative control）（上海吉瑪制藥技術公司，美國）；Western bolt相關試劑、RIPA蛋白裂解液（上海碧云天生物技術公司）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（Promega公司，美國）。

1.3 qRT-PCR

使用Trizol法提取標本總RNA，并用Nano-Drop2000紫外分光光度計檢測RNA 濃度和純度（A260：A280）。將miRNA 逆轉錄成cDNA，合成的cDNA產物直接用于PCR或保存于-20℃待用。采用SYBR GreenⅠ法進行miR-126的實時熒光定量檢測。反應體系如下：miR-127逆轉錄產物2μl，SYBR Green Mix 9μl，上下游引物各1μl，加入DEPC水將反應總體系配至20μl。PCR反應程序如下：預變性：94℃5 min，變性：94℃30 s，退火：58℃30 s，延伸：72℃30 s，設置30個反應循環。采用2-ΔΔCt法分析實驗結果。U6為miR-126內參。miR-126引物根據基因組數據庫設計，由上海吉瑪公司合成。

1.4 細胞轉染

口腔鱗癌細胞系SCC-4細胞置于恒溫CO2培養箱培養，待匯合度達80%左右加入Lipofectamine試劑進行轉染。將口腔鱗癌細胞分為3組，分別加入miR-126 agomir、miR-126 antagomir以及negative control。后將細胞置于5%CO2恒溫培養箱培育1～3 d以供檢測。

1.5 Western blot檢測PIK3R1蛋白表達水平

洗滌并收集SCC-4細胞，使用RIPA裂解液獲得蛋白，BCA法測定蛋白含量，后加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液煮沸。配制10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠，將蛋白樣品以20μl/孔上樣，設定70 V恒壓電泳，蛋白質轉印60 min，封閉1 h。后按照抗體說明書稀釋一抗，加入PVDF膜4℃孵育過夜。次日TBST洗滌后加入二抗，室溫孵育1 h后顯色，獲得圖像使用Image J軟件分析。

1.6 MTT法檢測細胞增殖能力

分別將轉染miR-126 agomir、miR-126 antagomir以及negative control的SCC-4細胞消化為懸液后接種至96孔板，每種細胞每孔接種量為2×103個，置于37℃5%CO2的恒溫培養箱中培養6 h，在每孔細胞中加入20μl MTT繼續培養4 h，將細胞培養液棄去，每孔加入DMSO 200μl，搖床混勻約10 min，用酶標儀測定A570nm光吸收值繪制細胞生長曲線。

1.7 Transwell遷移實驗

收集不同轉染組的SCC-4細胞，加入DMEM基礎培養基，使用計數板將細胞懸液吸出滴入計數板，統計計數板中四大格細胞數，調整細胞濃度，將1×103個細胞懸液加入transwell小室，并于24孔板下室加入500μl DMEM完全培養基；將24孔板置于恒溫培養箱中48 h，后取出小室移除培養基，將小室底膜進行甲苯胺藍染色。

1.8 雙熒光素酶報告基因檢測

根據Promega雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書，將包含有與相應miRNA-126互補結合的靶基因PIK3R1 3'-UTR序列片段和突變的3'-UTR序列片段克隆到pGL3-Luciferase基因下游的多克隆位點中。正常培養的Hela 493T細胞，以4×105個/ml接種于6孔培養板，每孔體積1 ml。轉染包含PIK3R1 3'-UTR或突變的PIK3R1 3'-UTR的熒光素酶質粒，以及miRNA-126 agomir、miRNA-126 antagomir或negative control。轉染48 h后收集293T細胞，進行雙熒光素酶活性檢測。

1.9 統計學分析

采用SPSS17.0進行統計學分析，計量資料用±s表示，2組間比較采用t檢驗，多組間分析用單因素方差分析，當P＜0.05時表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 miR-126在口腔鱗癌組織和正常組織中的表達

采用qRT-PCR檢測口腔鱗癌組織及正常口腔黏膜組織中miR-126的表達水平，結果顯示，miR-126在口腔鱗癌組織中表達降低，含量為正常口腔黏膜組織的0.64倍，具有顯著統計學差異（P＜0.05）（圖1）。

2.2 不同鱗癌細胞系中miR-126表達水平

采用qRT-PCR檢測正常口腔黏膜上皮細胞、SCC-4，SCC-9和SCC-15中miR-126表達水平，結果顯示，3種口腔鱗癌細胞中miR-126表達水平均低于正常口腔黏膜上皮細胞，其中SCC-9中表達水平最低，具有顯著統計學差異（P＜0.05；P＜0.01）。因此使用SCC-9進行后續實驗（圖2）。

2.3 細胞轉染效率檢測

在口腔鱗癌細胞中分別轉染miR-126 agomir、miR-126 antagomir以及negative control，采用qRT-PCR檢測轉染后miR-126表達水平，結果顯示miR-126 agomir可以顯著上調細胞中miR-126的表達水平，反之，加入miR-126 antagomir后其表達水平受到抑制，表達差異具有統計學意義（P＜0.05）（圖3）。

圖1 口腔黏膜正常組織和鱗癌組織中miR-126表達水平Fig 1 miR-126 expression in normal and oral mucosa and OSCC

圖2 不同口腔鱗癌細胞系中miR-126表達水平Fig 2 miR-126 expression levels in different OSCCcell lines

圖3 不同轉染條件下miR-126的表達水平Fig 3 miR-126 expression levels under different transfection conditions

2.4 miR-126對口腔鱗癌細胞增殖能力的影響

MTT法檢測不同處理組鱗癌細胞的增殖能力，顯示上調miR-126表達含量后，細胞增殖能力受到明顯抑制，反之，下調miR-126的表達后，細胞增殖能力明顯提高，結果具有顯著統計學差異（P＜0.05）（圖4）。

2.5 miR-126對口腔鱗癌細胞遷移能力的影響

使用transwell小室檢測不同處理組口腔鱗癌細胞的遷移能力，結果發現相較于對照組，上調miR-126后，細胞遷移能力受到抑制，反之，下調miR-126的表達后，細胞的增殖能力得到提高，結果具有統計學差異（P＜0.05）（圖5）。

圖4 不同轉染條件下對鱗癌細胞增殖能力的影響Fig 4 The effect of different transfection conditions on the proliferation of OSCCcells

圖5 不同轉染條件下對鱗癌細胞遷移能力的影響 （甲苯胺藍染色，×200）Fig 5 The effect of different transfection conditions on the migration ability of OSCC cells （Toluidine staining，×200）

2.6 雙熒光素酶報告基因檢測miR-126靶基因

為檢測miR-126可能的靶基因，搜索生物信息學網站miRanda和Targetscan，發現PIK3R1的3'UTR區存在miR-126的結合位點，因此推測miR-126可能調節PIK3R1的表達。同時，采用Western blot檢測不同轉染組中PIK3R1的表達水平，結果發現下調miR-126后PIK3R1的表達水平上升，反之，下調miR-126后PIK3R1的表達水平上升，差異具有統計學意義（P＜0.05）（圖6）。為進一步明確miR-126與PIK3R1存在直接結合，構建含有PIK3R1 3'UTR結合位點的熒光素酶報告基因表達載體。結果顯示，在含有PIK3R1 3'UTR序列的細胞中，加入miR-126后，較之對照組其熒光素酶活性明顯降低（P＜0.01），而在PIK3R1 3'UTR突變組中則無明顯改變（圖7）。

圖6 不同轉染條件下PIK3R1蛋白表達水平Fig 6 PIK3R1 protein expression under different transfection conditions

圖7 雙熒光素酶報告基因實驗Fig 7 Dual luciferase reporter experiment

3 討 論

MicroRNA是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。第一個miRNA是在20世紀90年代初發現的。然而，直到21世紀初，miRNA才被認為是具有獨特調節功能的一類物質。其自身通常不參與編碼合成mRNA，而是在轉錄后水平參與靶基因調控過程，其作用遍及生命體的發生、生長、發育、分化和死亡的各個過程。如楊倩娟等［9］發現miR-20可參與人炎癥牙周膜干細胞成骨分化過程。其他研究也發現細胞在發生病理過程中其miRNAs表達也發生不同變化［10］。2009年的一項研究探討了miR-205的表達水平對乳腺癌轉移的影響［11］。一項針對小細胞肺癌樣本的研究發現，miR-324a的水平可作為預測患者預后生存的指標［12］。近年來的研究發現miRNAs與口腔鱗癌的發生發展以及預后也有著緊密的關聯。Shin等［13］證實miR-181a在口腔鱗癌細胞中的表達量降低，而提高miR-181a的表達含量可以抑制其靶基因K-ras的表達從而抑制了鱗癌細胞的增殖能力。近年的一項納入了29例口腔鱗癌患者與7例健康對照者進行分析，通過檢測鱗癌細胞和正常口腔黏膜細胞的基因譜發現在口腔鱗癌腫瘤組織中有12個microRNAs上調及11 microRNA下調［14］。這些異常表達的microRNA可能與細胞增殖分化、凋亡、血管形成、腫瘤浸潤及轉移等多種功能相關。

MiR-126最初被發現在內皮細胞中表達，在血管新生中發揮著重要的作用［15］。最近的多項研究發現miR-126與腫瘤細胞的增殖與侵襲能力有關。如miR-126可通過RhoA/ROCK信號通路抑制結腸癌細胞的增殖和侵襲［16］。MiR-126還可靶向作用于PIK3R2介導的PI3K/Akt通過調節膽囊癌細胞的生物學功能［17］。然而，對于miR-126與口腔鱗癌的關系研究較少。Yang等［18］發現miR-126可以靶向于EGFL7來抑制口腔鱗癌細胞的細胞周期，此外，過表達miR-126可以抑制血管內皮生長因子（VEGF）和成纖維細胞生長因子（bFGF）的表達。本次研究通過生物信息學軟件預測miR-126可能的作用靶基因，并采用雙熒光素酶報告基因實驗等方法進一步驗證了miR-126與靶基因PIK3R1存在相關關系，證明了miR-126對于口腔鱗癌細胞生物學功能調節的可能作用機制。與此同時，采用miR-126的模擬物以及抑制物進行細胞轉染，一系列的體外實驗也均證實在口腔鱗癌細胞中改變miR-126的表達對于其生物學功能有著顯著的調節作用。

綜上所述，該研究發現口腔鱗癌細胞中，miR-126的表達水平顯著降低，同時改變miR-126的表達水平可以調節口腔鱗癌細胞的增殖和遷移能力，此外，miR-126可作用于PIK3R1發揮其調節作用；因此miR-126可能作為一個潛在的治療靶點，對于口腔鱗癌的治療提供新的思路。