乳源六肽預防和降低小鼠急性酒精性肝損傷及其機制

席 浩，劉沁雪，陳 曦，王 鵬，李敬文，姚曉煒，呂志昊，許 尹，秦宜德

研究[1-2]表明，生物活性肽具有抗氧化、抗高血壓、抗腫瘤的生物學功能，同時能夠修復受損的肝細胞。乳源免疫調節肽(immunomodulating peptide，PGPIPN)主要來自于α、β和κ-酪蛋白,多數為3～9個氨基酸殘基的短肽[3-4]。目前實驗室前期研究證實，PGPIPN具有加快酒精代謝，并顯著降低血清中總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST)活性的能力。由于PGPIPN良好的免疫調節功能和抗氧化作用[5-6]，現通過高濃度酒精連續灌胃的方法建立小鼠急性酒精性肝損傷模型，探究PGPIPN的相關作用機制，以期進一步探究PGPIPN的藥理學作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康的60只昆明種雄性小鼠，清潔級，18～22 g，由安徽醫科大學實驗中心提供，飼養在安徽醫科大學實驗動物中心。

1.2 試劑北京紅星牌56°二鍋頭酒(北京紅星股份有限公司)； PGPIPN(上海生物工程技術有限公司合成)；谷胱甘肽片(glutathione,GSH,重慶藥友制藥有限公司生產)。TNF-α含量檢測采用北京北方生物技術研究所的試劑盒，ALT、AST、TG和TC的含量檢測采用南京建成生物工程研究所的試劑盒。改良型CBA法蛋白質濃度測定試劑盒由上海生物工程技術有限公司提供。

1.3 儀器ST16R低速冷凍離心機(美國賽默飛世爾科技公司)；Multiskan Go全波長酶標儀(美國賽默飛世爾科技公司)；倒置顯微鏡T300型(尼康儀器上海有限公司)；自動放免儀(中國科大中佳公司)；羅氏全自動生化分析儀(瑞士羅氏公司)。

1.4 分組60只昆明種小鼠，適應性喂養1周，然后分成6組：對照組、模型組、PGPIPN L組、PGPIPN M組、PGPIPN H組和GSH組，每組10只小鼠。分別以0.04、0.4、4 mg/kg進行灌胃；陽性對照GSH組以谷胱甘肽片200 mg/kg灌胃。持續灌胃2 d，每天1次。正常組和模型組以等量蒸餾水進行灌胃。進行到給藥第12天開始，模型組及各給藥組小鼠以56°紅星二鍋頭酒灌胃，16 ml/kg，持續3 d，每天1次。正常組使用等量蒸餾水替代灌胃。各組小鼠均正常飼養。24 h后頸椎脫臼處死小鼠，取相關組織檢測指標。

1.5 血清和肝勻漿提取末次灌胃結束后12 h內禁食處理，將各組小鼠稱重，分離血清，測定血清中ALT和AST含量。取肝左葉約1.0 g，剪碎研磨，使用勻漿儀制成10%肝勻漿， 4 ℃ 4 000 r/min離心8 min，取上清液用CBA法檢測新鮮制作的肝勻漿中蛋白質含量，測定肝臟中TG含量;按試劑盒說明操作,使用放射免疫檢測TNF-α的含量。

1.6 免疫組化和原位末端轉移酶標記技術檢測(Tunel detection，Tunel)將小鼠的肝臟組織用10%的甲醛溶液固定、梯度酒精濃度脫水、石蠟包埋、切片，制作常規組織切片，使用Tunel試劑盒染色，熒光倒置顯微鏡觀察。

1.7 分離原代肝臟組織測定細胞的凋亡將小鼠用水合氯醛麻醉，在解剖臺上固定，打開腹腔，找到門靜脈和下腔靜脈。從門靜脈入針，注入灌流液Ⅰ(250 ml Krebs Ringer with Glucose中加入0.5 ml 50 mmol/L EGTA)，待肝臟組織灰白，將灌流液換成膠原酶Ⅰ，灌流至肝臟出現皸裂或水泡停止。抖落細胞，400目濾網過濾，靜置后離心，用流式細胞術檢測細胞的凋亡。

2 結果

2.1 PGPIPN對體質量、肝重和肝指數的影響與對照組相比，模型組的小鼠體質量下降，肝指數增大，組間差異有統計學意義(F=57.92，P<0.05)。圖1C可見，與模型組相比，GSH組和PGPIPN H組的肝指數降低;同時 PGPIPN M組和PGPIPN L組小鼠肝指數有降低的趨勢，但差異無統計學意義。

2.2 PGPIPN減輕小鼠酒精性肝損傷

2.2.1PGPIPN對小鼠血清中ALT和AST含量的影響 與對照組相比，模型組小鼠血清中的ALT和AST活性增加，并且PGPIPN的濃度越高，ALT和AST的活性降低，各組間差異有統計學意義(F=132.47，P<0.01)。見圖2。

2.2.2PGPIPN對小鼠肝勻漿中TNF-α含量的影響 放射免疫法測定肝勻漿中 TNF-α含量，首先要測定標準樣品中含量，繪制標準樣品曲線圖，再根據待測樣品中的CPM值反求濃度值。與對照組相比，模型組中小鼠體內的 TNF-α含量升高。與模型組相比，PGPIPN H組、 PGPIPN M組和PGPIPN L組中的TNF-α含量降低，各組間差異有統計學意義(F=712.35，P<0.01)。見圖3。

圖1 小鼠體質量、肝重和肝指數變化

A：體質量；B：肝重；C：肝指數；1：對照組；2：模型組；3：GSH組；4：PGPIPN L組；5：PGPIPN M組；6：PGPIPN H組；與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.3 PGPIPN降低小鼠肝細胞脂肪含量生化分析顯示模型組小鼠血清中TG、TC和肝臟勻漿中TG含量均高于對照組，且PGPIPN H組、 PGPIPN M組和PGPIPN L組中的TG、TC含量降低，各組間差異有統計學意義(F=394.85，P<0.01)，說明PGPIPN可能是通過調節脂質的代謝來預防急性酒精性肝損傷的。見圖4。

圖2 PGPIPN對小鼠血清中ALT、AST含量變化的影響

A：ALT；B：AST；1：對照組；2：模型組；3：GSH組；4：PGPIPN L組；5：PGPIPN M組； 6：PGPIPN H組；與對照組比較：**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01

圖3 PGPIPN對小鼠肝臟TNF-α的含量影響

1：對照組；2：模型組；3：GSH組； 4：PGPIPN L組；5：PGPIPN M組；6：PGPIPN H組；與對照組比較：**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01

2.4 PGPIPN降低小鼠肝細胞凋亡

2.4.1Tunel染色的組織學分析 應用Image J對熒光圖片進行半定量分析，熒光密度總和/區域面積=平均光密度，計算凋亡指數。與對照組相比，模型

圖4 PGPIPN對小鼠血清中TG/TC和肝勻漿中TG含量變化的影響

1：對照組；2：模型組；3：GSH組；4：PGPIPN L組；5：PGPIPN M組；6：PGPIPN H組；與對照組比較：*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05,##P<0.01

組肝臟組織有明顯的病理變化。對照組肝細胞結構完整，肝索結構清晰，肝小葉排布整齊，肝細胞邊界清晰，無明顯壞死現象。模型組中肝索結構紊亂，液泡數目增加，肝細胞邊界不清晰，細胞核消失，細胞皺縮。見圖5、表1。

表1 各組小鼠肝細胞凋亡指數

與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.4.2流式細胞術檢測肝臟細胞凋亡情況 與對照組相比，模型組小鼠肝臟細胞早期凋亡嚴重，說明小鼠的急性酒精性肝損傷模型造模成功。與對照組比較，PGPIPN H組、 PGPIPN M組和PGPIPN L組中凋亡細胞比例降低，各組間差異有統計學意義(F=1187.42，P<0.05)。見圖6、7。

3 討論

根據前期的研究[7]表明PGPIPN具有增強免疫調節和緩解炎癥反應的功能。急性酒精性肝損傷的發生機制就是短時間內大量攝入酒精導致乙醇及其代謝產物對肝臟組織的損傷[8]，主要是氧化應激導致的炎癥反應[9]。在急性酒精性肝損傷的初始階段，肝臟組織內的TG和TC含量升高，致使脂肪變性[10]，AST和ALT含量急劇升高，過氧化反應明顯。

圖5 各組小鼠肝臟組織的凋亡變化 ×200A：對照組；B：模型組；C：GSH組；D：PGPIPN L組；E：PGPIPN M組；F：PGPIPN H組

圖6 流式細胞術檢測各組小鼠肝臟細胞的凋亡變化A: 對照組; B: 模型組; C: GSH組; D:PGPIPN L組; E:PGPIPN M組; F:PGPIPN H組

圖7 PGPIPN對小鼠肝臟細胞凋亡百分比的影響

1:對照組；2:模型組；3:GSH組；4:PGPIPN L組；5:PGPIPN M組；6:PGPIPN H組；與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

PGPIPN可提高肝臟細胞的抗氧化能力，清除大量攝入酒精產生的自由基，從而對肝臟細胞進行保護。在急性酒精性肝損傷的后期階段，肝臟細胞中的TNF-α含量大量增加，TNF-α作為標志性的炎性因子是由單核巨噬細胞產生的，參與機體的免疫調節，與發熱和炎癥的發生相關，是典型的促炎細胞因子。TNF-α人體內最重要的靶器官就是肝臟，正常狀態下，機體內的TNF-α含量較低，但發生病理現象時，TNF-α的分泌大量產生，引起各種炎性因子迅速增加，導致炎癥反應的發生，對細胞組織損傷嚴重。根據上述實驗結果表明，本研究構建的小鼠急性酒精肝損傷模型是十分成功的。

通過病理學研究也可以看出，正常狀態下，肝細胞結構完整，肝索結構清晰，肝小葉排布整齊，肝細胞邊界清晰，未見細胞皺縮或鼓脹，無明顯壞死現象。而肝臟組織在短時間內大量攝入酒精會導致肝索結構紊亂，液泡數目增加，肝細胞邊界不清晰，細胞核消失，肝細胞間存在明顯的炎性浸潤。PGPIPN H組、 PGPIPN M組在PGPIPN的保護作用下，病理狀態明顯改善。

短時間內大量攝入酒精會導致肝臟組織脂肪變性，與酒精攝入產生的自由基結合導致氧化應激炎癥反應的發生。實驗證明了PGPIPN在體內能夠有效地緩解短時間內大量酒精攝入對肝臟組織細胞的損傷，為臨床上治療急性酒精性肝損傷提供理論依據。