Tenascin-C對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞錨定非依賴性生長(zhǎng)的影響

魯梅芳，黃 浩，劉小艷，陳劉贈(zèng)，劉新華，李 洪

胃癌(gastric cancer，GC)是一種常見(jiàn)的胃腸道腫瘤，是世界上第四大常見(jiàn)癌癥。超過(guò)90%的GC是源自胃黏膜上皮的腺癌。目前，手術(shù)仍然是早期疾病的唯一有效的治療方法，但因其早期癥狀不易察覺(jué)，所以其早期診斷率較低[1]。晚期GC患者在現(xiàn)有的治療手段下預(yù)后不佳。因此確定GC用于早期診斷和靶向治療的生物標(biāo)志物變得越來(lái)越重要[2]。肌腱蛋白C(Tenascin-C， TNC)是一種細(xì)胞外糖蛋白，在細(xì)胞增殖和遷移及器官發(fā)生等過(guò)程中產(chǎn)生[3-4],已被廣泛研究作為不同癌癥的潛在生物標(biāo)志物。到目前為止TNC在GC中的功能還不清楚。TNC可以與表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、整聯(lián)蛋白[5-6]相互作用來(lái)調(diào)節(jié)許多細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子如局部粘著斑激酶、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)的活性，從而在細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮多種作用[7]。該研究采用免疫組化法檢測(cè)TNC在GC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步探討了TNC在SGC7901細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 樣本本實(shí)驗(yàn)中使用的標(biāo)本是從解放軍105醫(yī)院手術(shù)取出的原發(fā)性GC和活組織檢查中收集的。其中10例胃腺癌病例為男性，8例為女性，年齡39～80(55.5±8.6)歲。患者在手術(shù)前均未接受化療，該研究均獲得患者知情同意書(shū)，并得到倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料及儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；RPMI-1640 DMEM(美國(guó)Hyclone公司)；嘌呤霉素(美國(guó)sigma公司)；抗磷酸化AKT、抗AKT Ser 473、抗ERK、抗磷酸化ERK、T202/Y204、抗-ITGB5、8(美國(guó)Cell Signaling公司)；TNC、通用型二抗(英國(guó)Abcam公司)； pSpcas(BB)-2A-puro載體(北京質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞基因保藏中心)；Lipofectamine 2000(美國(guó)賽默飛公司)；抗磷酸-JNK、抗JNK T183/Y185(美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司)；抗ITGB1、4、7(武漢三鷹生物科技有限公司)；極超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；總RNA提取試劑(北京天根生化科技有限公司)

1.3 免疫組化將石蠟樣品制成5 μm切片，用二甲苯和梯度乙醇脫蠟。然后通過(guò)浸泡在0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中進(jìn)行抗原修復(fù)。之后將切片浸入3%過(guò)氧化氫中以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶。在室溫下濕盒中用5%山羊血清封閉。一抗TNC(1 ∶100)4 ℃孵育過(guò)夜。 洗滌3次后，二抗山羊抗兔(1 ∶2 000)37 ℃下孵育1 h。之后切片洗滌并用蘇木精復(fù)染，然后脫水并封片。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞系MGC803 SGC7901 NCI-N87(102155)、MKN28(338339)和AGS(102154)購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。其中，GES-1 AGS NCI-N87細(xì)胞用含有10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)，其他細(xì)胞在含有10% FBS的DMEM中培養(yǎng)。所有細(xì)胞都在維持37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系使用(http://crispr.mit.edu)在線設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì)引導(dǎo)RNA(guide RNA, gRNA)，選擇具有高特異性的3對(duì)gRNA，見(jiàn)表1。合成的引物退火，PCR反應(yīng)條件為90 ℃、4 min；75 ℃、5 min；65 ℃、15 min；25 ℃、20 min。然后用BBSI酶消化pSpcas(BB)-2A-puro載體。將酶切后的載體與退火的引物在22 ℃下連接2 h或16 ℃過(guò)夜。載體構(gòu)建完成篩選正確后，通過(guò)Lipofectamine 2000將它們轉(zhuǎn)染到SGC7901細(xì)胞中，然后用嘌呤霉素篩選TNC缺陷的SGC7901細(xì)胞系作為敲除(konck out, KO)組。同時(shí)設(shè)計(jì)非靶向的空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SGC7901作為MOCK對(duì)照組，正常的SGC7901作為正常對(duì)照(control，CN)組。篩選后，收集培養(yǎng)基用于Western blot驗(yàn)證。設(shè)計(jì)的3對(duì)gRNA中第1對(duì)具有最佳的敲除效果。

表1 gRNA

1.6Westernblot收集細(xì)胞和培養(yǎng)基并加入蛋白上樣緩沖液以制備蛋白質(zhì)樣品。然后使用10%SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶封閉，在室溫下孵育2 h或在4 ℃下孵育過(guò)夜。然后孵育一抗，抗磷酸化AKT(Ser 473,1 ∶1 000)；抗AKT(1 ∶1 000)；抗磷酸-JNK(T183/Y185)(1 ∶500)；抗JNK(1 ∶500)；抗磷酸化ERK(T202/Y204,1 ∶1 000)；抗ERK(1 ∶1 000)；抗整合素β1、4、7(1 ∶500)；抗-ITGB5、8(1 ∶1 000)用含1%牛奶的TBST稀釋4 ℃孵育過(guò)夜。然后加入足量的抗IgG二抗(抗小鼠或抗兔IgG)，用2.5%脫脂牛奶1 ∶5 000稀釋于TBST中。將膜在室溫下孵育2 h并用TBST洗滌，顯影。

1.7 軟瓊脂生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)首先將1.2%瓊脂糖凝膠與2×DMEM以1 ∶1的比例混合，并將10 ml混合物倒入10 cm培養(yǎng)皿中。冷卻并凝固后，放入CO2培養(yǎng)箱備用。接下來(lái)將細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，消化并輕輕吸打它們以制備單個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。之后在無(wú)菌試管中以1 ∶1的比例混合0.7%瓊脂糖和2×DMEM，然后加入細(xì)胞懸浮液并充分混勻注入培養(yǎng)皿中，并逐漸形成雙瓊脂層。待上層瓊脂固化后，將其置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約2周，每2～3 d加入培養(yǎng)基以防止其過(guò)于干燥。兩周后用結(jié)晶紫染色。染色2 h后，用脫色液脫色直至克隆可見(jiàn)。

1.8RT-PCR選取SGC7901TNC-/-細(xì)胞系和對(duì)照組SGC7901細(xì)胞，用天根總RNA提取試劑盒提取RNA，RNA提取后先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后進(jìn)行RT-PCR。PCR中使用的引物見(jiàn)表2。

表2 PCR引物

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Graphpad進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNC在胃癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)TNC蛋白在正常和惡性胃黏膜組織中的表達(dá)狀態(tài)。使用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)了18個(gè)胃腺癌及其癌旁正常黏膜組織中的TNC蛋白。來(lái)自12個(gè)胃腺癌的組織顯示較強(qiáng)的TNC染色信號(hào)并且主要集中在細(xì)胞外間隙。在相同條件下，在正常胃黏膜組織中未檢測(cè)到陽(yáng)性TNC免疫染色信號(hào)，見(jiàn)圖1A、1B。研究結(jié)果表明TNC在胃腺癌中的表達(dá)增加，并且它可能促進(jìn)GC的發(fā)展和進(jìn)程，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的較高表達(dá)水平通常代表其在該腫瘤中促進(jìn)腫瘤作用的線索。為了進(jìn)一步了解GC中TNC的功能，研究了其在培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞系中的行為，以確認(rèn)其在細(xì)胞培養(yǎng)水平中的腫瘤促進(jìn)作用。在正常胃上皮細(xì)胞系GES-1細(xì)胞中未檢測(cè)到TNC蛋白，而在5種檢測(cè)的GC細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)到其中有4個(gè)細(xì)胞系明顯存在TNC蛋白，其中SGC7901細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)水平最高，因此用于以下實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖1C。

圖1 TNC在組織和細(xì)胞系中的表達(dá)情況 SP×200

A：GC組織；B：癌旁組織；C：不同GC細(xì)胞和胃黏膜細(xì)胞

2.2 SGC7901細(xì)胞的軟瓊脂生長(zhǎng)依賴于TNC表達(dá)將SGC7901和SGC7901TNC-/-細(xì)胞均以每孔103個(gè)細(xì)胞的濃度接種到6孔板中的軟瓊脂中，并在接種2周后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。發(fā)現(xiàn)正常的SGC7901細(xì)胞每孔平均形成126.37個(gè)菌落，而即使延長(zhǎng)時(shí)間觀察，在培養(yǎng)良好的SGC7901TNC- /-細(xì)胞中基本無(wú)菌落，見(jiàn)圖2。這些結(jié)果意味著TNC對(duì)SGC7901細(xì)胞的錨定非依賴性生長(zhǎng)具有必要的作用。

2.3 TNC敲除抑制了多種促進(jìn)生長(zhǎng)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑Western blot結(jié)果顯示在SGC7901TNC-/-細(xì)胞中AKT、JNK和ERK的表達(dá)水平與SGC7901細(xì)胞中無(wú)顯著性差異，而AKT和JNK磷酸化蛋白的水平顯著降低，見(jiàn)圖3。結(jié)果表明缺乏TNC導(dǎo)致關(guān)鍵蛋白的失活，從而抑制這些促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)通路中蛋白的激活。

圖2 敲除TNC組和對(duì)照組SGC7901 軟瓊脂集落形成對(duì)比1:第1次實(shí)驗(yàn)結(jié)果；2：第2次實(shí)驗(yàn)結(jié)果；3：第3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3 JNK、AKT和ERK蛋白總表達(dá)量和磷酸化蛋白量表達(dá)情況

CN：正常SGC7901對(duì)照；KO：TNC缺陷SGC7901細(xì)胞系(SGC7901TNC-/-);MOCK：轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒空白對(duì)照;與MOCK組比較：***P<0.001；與CN組比較：###P<0.001

2.4 TNC KO降低SGC7901細(xì)胞中ITGB7的表達(dá)Western blot檢測(cè)了SGC7901和SGC7901TNC-/-細(xì)胞中整聯(lián)蛋白的所有β亞基的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)整合素β7(integrin β7， ITGB7)的蛋白表達(dá)明顯降低，且通過(guò)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ITGB7 mRNA僅存在于SGC7901細(xì)胞中，但不存在于SGC7901TNC-/-細(xì)胞中，而整聯(lián)蛋白其他β亞基在兩種細(xì)胞系中mRNA水平中均未顯示出顯著性差異，Western blot僅檢測(cè)出5種整聯(lián)蛋白。見(jiàn)圖4。

圖4 整合蛋白β亞型在蛋白和mRNA水平的表達(dá)量

A：整合蛋白β亞型在蛋白水平的表達(dá)量；B：蛋白條帶灰度值的定量分析；C：整合蛋白β亞型在mRNA水平的表達(dá)情況；CN：正常SGC7901對(duì)照；KO：TNC缺陷SGC7901細(xì)胞系(SGC7901TNC-/-)；MOCK：轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒空白對(duì)照;與MOCK組比較：***P<0.001；與CN組比較：###P<0.001

3 討論

TNC已被證明與許多不同的癌癥有關(guān)，其過(guò)表達(dá)在癌癥診斷和預(yù)后方面具有許多功能和臨床意義[8]。有研究[9]表明TNC表達(dá)增加與GC預(yù)后呈正相關(guān)。本研究進(jìn)一步證實(shí)了GC組織中的TNC表達(dá)量比癌旁組織中表達(dá)高。同時(shí)在培養(yǎng)的GC細(xì)胞培養(yǎng)基中檢測(cè)到TNC蛋白，而未從正常的胃黏膜上皮細(xì)胞中檢測(cè)到TNC蛋白。陽(yáng)性表達(dá)通常提示為癌癥的潛在標(biāo)志物，因此該研究結(jié)果支持TNC作為早期檢測(cè)GC的有價(jià)值的生物標(biāo)志物。

作為多種細(xì)胞功能和表型的調(diào)節(jié)劑，TNC可以調(diào)控多種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和基因表達(dá)。TNC在不同類(lèi)型的癌癥中具有不同的作用，如乳腺癌、骨髓干細(xì)胞和胰腺癌等分別與生存、增殖、轉(zhuǎn)移和遷移有關(guān)[7,10-12]。為了研究TNC在GC細(xì)胞中的作用，使用基因編輯技術(shù)產(chǎn)生了TNC缺陷的SGC7901細(xì)胞系(SGC7901TNC-/-)。基因的缺失通常導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)缺陷，但是當(dāng)在正常條件下培養(yǎng)SGC7901TNC-/-和正常SGC7901細(xì)胞時(shí)，沒(méi)有觀察到生長(zhǎng)差異。因此，著重研究了TNC敲除對(duì)軟瓊脂中SGC7901細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。本研究主要發(fā)現(xiàn)胃癌SGC7901細(xì)胞中TNC敲除后導(dǎo)致其在軟瓊脂中的集落形成能力完全喪失，提示其功能是參與GC生長(zhǎng)。正常的細(xì)胞一般需要依附在一定的基質(zhì)上面才能生長(zhǎng)，一旦脫離基質(zhì)就會(huì)成為球狀從而不能增殖，而腫瘤細(xì)胞和癌變轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠在這種狀態(tài)下生長(zhǎng)，而錨定非依賴性生長(zhǎng)是惡性細(xì)胞的關(guān)鍵特征之一，因此TNC缺陷細(xì)胞在軟瓊脂中的生長(zhǎng)缺陷說(shuō)明了其在促進(jìn)細(xì)胞增殖或維持惡性狀態(tài)中的必要性。作為細(xì)胞外因子，可以通過(guò)治療性抗體或其他藥物有效的阻斷TNC效應(yīng)，因此開(kāi)發(fā)TNC相關(guān)藥物可能是發(fā)展GC新的診斷、治療和生物工具的一種潛在途徑。

研究[12]發(fā)現(xiàn)許多細(xì)胞內(nèi)生物級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與激活TNC的致癌活性。例如，TNC通過(guò)激活JNK/c-Jun信號(hào)通路[10]誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、抗凋亡和侵襲，并通過(guò)增強(qiáng)AKT磷酸化促進(jìn)軟骨細(xì)胞的存活等。假設(shè)TNC可以通過(guò)在這些生長(zhǎng)促進(jìn)途徑上起作用來(lái)促進(jìn)和維持SGC7901細(xì)胞的惡性特征，那么TNC的喪失將會(huì)導(dǎo)致SGC7901細(xì)胞在軟瓊脂中的生長(zhǎng)缺陷。基于該假設(shè)，在SGC7901細(xì)胞中敲除TNC后，這些生長(zhǎng)信號(hào)傳導(dǎo)途徑至少有一種會(huì)受到影響。為了證實(shí)這一設(shè)想，通過(guò)Western blot分析了SGC7901和SGC7901TNC-/-細(xì)胞中AKT、JNK、ERK及其相應(yīng)的磷酸化同種型的表達(dá)。類(lèi)似地，在SGC7901細(xì)胞中的結(jié)果表明，敲除TNC導(dǎo)致AKT和JNK的磷酸化顯著降低，表明多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑負(fù)責(zé)維持TNC致癌活性。TNC含有表皮生長(zhǎng)因子樣重復(fù)序列和N末端多達(dá)17個(gè)纖連蛋白Ⅲ型樣重復(fù)序列的區(qū)域，它可以直接與整聯(lián)蛋白和EGFR家族受體相互作用，以激活多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路。考慮到SGC7901TNC-/-細(xì)胞的生長(zhǎng)缺陷歸因于多種生長(zhǎng)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，首先關(guān)注到的是EGFR家族受體，因?yàn)樗鼈冊(cè)诩?xì)胞增殖控制中起重要作用，然而在SGC7901細(xì)胞中未檢測(cè)到EGFR家族受體表達(dá)異常。之后聚焦于是否TNC的缺失影響了整合素的表達(dá)。在TNC敲除的情況下，發(fā)現(xiàn)ITGB7的表達(dá)在蛋白質(zhì)和mRNA水平均顯著降低。雖然目前尚不清楚為什么TNC敲除導(dǎo)致ITGB7在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的下調(diào)，推測(cè)出TNC和ITGB7之間可能存在反饋回路，因此TNC的缺失可能導(dǎo)致ITGB7內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞以抑制其轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。雖然整合素是TNC信號(hào)的主要轉(zhuǎn)導(dǎo)因子之一，但I(xiàn)TGB7是否介導(dǎo)TNC對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞的錨定非依賴性生長(zhǎng)仍需進(jìn)一步研究。