鈣對人系膜細胞增殖及1,25-D3-MARRS蛋白表達的影響

任國臣，劉 剛，趙 丹，顧 杰，楊曉萍

系膜細胞為腎臟固有細胞，其異常增殖是原發性腎小球腎炎向終末期腎臟病(end stage renal disease, ESRD)進展的重要環節。研究[1-2]顯示，系膜細胞的增殖可以受1,25(OH)2D3和鈣的調節， 其中1,25(OH)2D3對靶細胞的調控機制可分為兩種，即通過核受體(nVDR)的基因組機制和膜受體(1,25-D3-MARRS)的非基因組機制[3]。有研究發現1,25(OH)2D3和鈣可通過調節nVDR的表達來發揮對細胞生長的作用[4]，而近期人們對于人系膜細胞中有沒有nVDR的表達說法并不一致[5-6]，課題組前期已證實：1,25(OH)2D3可以抑制系膜細胞增殖，誘導細胞凋亡[2]，但其是否是通過活化維生素D受體來發揮作用，以及鈣對該過程的調節作用不得而知。1,25(OH)2D3和鈣是否可以通過非基因組機制來發揮作用，而鈣是否可以通過單獨影響1,25-D3-MARRS的表達來調節系膜細胞的增殖也尚無研究。該研究通過觀察不同濃度鈣離子對人系膜細胞增殖及對1,25-D3-MARRS表達的影響，進而探討鈣對人系膜細胞作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器CCK-8試劑盒(上海同仁化學研究所);氯化鈣(上海生工生物公司);低糖DMEM培養基(美國Gibco公司);胎牛血清 (FBS，以色列BI公司);小鼠抗人ERP57單克隆抗體(美國Santa公司,B-5);山羊抗小鼠IgG FITC、山羊抗小鼠IgG二抗(中國北京中杉金橋公司);激光共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司)。

1.2 細胞株及細胞培養人腎小球系膜細胞株由湘雅醫學院中心實驗室提供。用含10% FBS的DMEM完全培養基復蘇系膜細胞，置于5%CO2、37 ℃飽和濕度培養箱中培養，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 藥物干預及分組按實驗目的分為3組：正常對照組(含5% FBS DMEM培養基)、低鈣組(含10-4mol/L氯化鈣的DMEM培養基)、高鈣組(含1.8×10-3mol/L氯化鈣的DMEM培養基)。

1.4 CCK-8法檢測各組細胞增殖情況取系膜細胞接種于96孔板，藥物干預后于培養箱中孵育48 h,干預時間結束前4 h吸出孔內的培養基，加入含CCK-8溶液(10 μl/孔)的新鮮培養基，培養箱中繼續孵育1～4 h,酶標儀測定各孔于450 nm波長處的吸光度(OD)值，每組設6個復孔，實驗重復3次，計算抑制率(inhibition rate，IR)=(Ac對照組值-As實驗組值)/(Ac對照組值-Ab空白組值)×100%。

1.5 免疫熒光染色法檢測1,25-D3-MARRS蛋白的定位及半定量表達取藥物干預48 h后已爬片系膜細胞，4%多聚甲醛固定20 min，1×PBS洗3次，5% BSA封閉30 min，小鼠抗人ERP57單克隆抗體(1,25-D3-MARRS)(1 ∶50)孵育，4 ℃過夜，山羊抗小鼠IgG FITC(1 ∶100)室溫孵育1 h，1×PBS洗3次，PI染色，抗熒光淬滅劑封片，激光共聚焦采圖、AIM軟件測定熒光強度。

1.6 RT-PCR法檢測1,25-D3-MARRS的mRNA含量取干預48 h后各組細胞，TRIzol法提取總RNA，逆轉錄為cDNA。1,25-D3-MARRS上游引物序列為：5′-CTGAGCTAGCCGCAAAACC-3′，下游引物：5′-CAGAGCCTTCCCATCACG-3′; β-actin上游引物序列為：5′-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′，下游引物：5′-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。按照試劑盒說明書，PCR總反應體積為20 μl，42 ℃、60 min行反轉錄，70 ℃、5 min使反轉錄酶失活。PCR反應條件: 95 ℃、30 s，60 ℃、1 min，40個循環。記錄每個目的基因擴增的Ct閾值，以相應的β-actin為內參，采用2-ΔΔCt計算mRNA相對表達量。

1.7 Western blot法檢測1,25-D3-MARRS蛋白的表達取藥物干預48 h各組細胞，細胞裂解液(RIPA:PMSF=100 ∶10)裂解細胞，根據試劑盒說明書分別提取總蛋白，煮沸使蛋白變性。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，ERP57單克隆抗體(1 ∶100)作為目的蛋白，β-actin(1 ∶1 000)作為內參，4 ℃過夜。山羊抗小鼠二抗(1 ∶10 000) 37 ℃孵育2 h，洗膜后顯色，暗室內膠片曝光。采圖后Gel-pro軟件圖像數據分析灰度值。

2 結果

2.1 各組細胞增殖情況比較不同濃度鈣離子干預系膜細胞48 h后，CCK-8法檢測正常對照組、低鈣組、高鈣組OD值，分別為：(1.574 4±0.063 8)、1.235 4±0.044 9)、(1.699 6±0.056 5)。與正常對照組相比，低鈣組OD值較高，高鈣組OD值較低；與低鈣組相比，高鈣組OD值較低，差異均有統計學意義(F=18.65，P<0.01)。抑制率：低鈣組抑制率(21.5%)顯著高于正常對照組，高鈣組(-7.9%)低于正常對照組，提示低濃度鈣離子(10-4mol/L)可顯著抑制系膜細胞的增殖，高濃度鈣離子(1.8×10-3mol/L)可以促進系膜細胞的增殖。

2.2 各組1,25-D3-MARRS蛋白的定位及熒光強度比較各組1,25-D3-MARRS蛋白均以胞膜表達為主，部分表達在胞質及胞核，見圖1。正常對照組、低鈣組、高鈣組1,25-D3-MARRS蛋白的表達量分別為：(29.97±8.625 1)、(59.93±3.521 5)、(12.09±0.605 3)。與正常對照組比較，低鈣組蛋白表達量較高；與低鈣組比較，高鈣組蛋白表達量較低，差異均有統計學意義(F=105.6，P<0.05)。與正常對照組比較，高鈣組蛋白表達量降低，但差異無統計學意義。

圖1 1,25-D3-MARRS蛋白的定位表達 ×200

A：正常對照組；B：低鈣組；C：高鈣組； 箭頭所指：1,25-D3-MARRS蛋白表達部位

2.3 各組1,25-D3-MARRS mRNA含量比較不同濃度鈣離子干預后，正常對照組、低鈣組、高鈣組系膜細胞的1,25-D3-MARRS mRNA含量分別為：(1.00±0.00)、(3.699 6±0.713 2)、(0.922 1±0.188 0)。與正常對照組比較，低鈣組1,25-D3-MARRS mRNA含量較高，與低鈣組比較，高鈣組含量較低，差異均有統計學意義(F=13.795，P<0.05)。與正常對照組比較，高鈣組含量降低，但差異無統計學意義。

2.4 各組1,25-D3-MARRS蛋白表達量比較與正常對照組比較，低鈣組蛋白表達較高；與低鈣組比較，高鈣組蛋白表達較低，差異均有統計學意義(F=18.65，P<0.05)。與正常對照組相比，高鈣組蛋白表達量降低，差異無統計學意義。見圖2。

3 討論

慢性腎臟病(Chronic kidney disease, CKD)的患病率逐年升高，帶來了沉重的經濟壓力和嚴重的社會問題，并最終可發展為ESRD。在我國，導致ESRD的主要病因是原發性腎小球疾病，其中又以系膜增生性腎小球腎炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN)最為常見。該病的主要病理改變是系膜細胞異常增殖和系膜基質增多，繼而導致小球硬化及間質纖維化，最終引起ESRD[7]。因此尋求逆轉或緩解系膜細胞異常增殖的方法具有重要意義。

圖2 各組系膜細胞1,25-D3-MARRS蛋白的表達

A：正常對照組；B：低鈣組；C：高鈣組；與正常對照組比較：*P<0.05; 與低鈣組比較：#P<0.05

鈣參與了腎小球系膜細胞增殖、凋亡、轉錄等多種重要過程[8]。而慢性腎臟病患者早期便可出現鈣磷代謝的紊亂，故糾正其紊亂在慢性腎臟病發展的進程中具有重要意義[9]。研究[10]表明細胞內外Ca2+水平的變化與系膜細胞的增殖有關，細胞外不同濃度的Ca2+所發揮的作用不同，細胞外高鈣狀態可以激活細胞表面蛋白鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CaSR)，通過人系膜細胞中的TRPC3和TRPC6通道介導Ca2+內流和細胞增殖。典型的生理Ca2+水平是接近1.3×10-3mol/L，遠低于CaSR活化所需的濃度。因此，本研究選取10-4mol/L和1.8×10-3mol/L的Ca2+濃度分別作為低鈣和高鈣的條件[11]。CCK-8法檢測結果顯示：高鈣具有促進系膜細胞增殖的作用，而低鈣可以抑制其增殖。從而驗證該濃度的Ca2+可用于對系膜細胞增殖作用的研究。此外推測，高濃度Ca2+可通過使CaSR活化來介導鈣離子內流，從而達到促進細胞增殖的作用，而低濃度Ca2+未能使CaSR活化，對系膜細胞的增殖出現了抑制作用，為進一步的研究提供理論基礎。

1,25-D3-MARRS結合蛋白是一種應激反應蛋白，與ERP57、GRP60同源，均屬于二硫異構蛋白酶3(PDIA3)蛋白家族，是活性維生素D3發揮作用的非基因組機制[4]。近期研究[12]顯示，1,25-D3-MARRS/ERp57不僅可以促進小腸對鈣磷的快速吸收作用，在多種腫瘤組織中的異常表達也與抑制腫瘤細胞的增殖有關。1,25(OH)2D3可與細胞膜表面的1,25-D3-MARRS /ERp57結合后，先后激活磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)，最終導致PLC釋放。研究[8]表明，Ca2+是系膜細胞中PLA2活性的重要生理調節劑，Ca2+在生理范圍(10-4～10-3mol/L)內增加時，可增強PLA2活性，因此推測，Ca2+在生理范圍內的增加可抑制系膜細胞的增殖，但其是否與活性維生素D膜相關快速反應結合蛋白1,25-D3-MARRS有關尚不明了。

既往研究顯示，1,25(OH)2D3通過與1,25-D3-MARRS蛋白結合發揮的非基因組機制需要Ca2+/鈣調蛋白依賴性激酶II(CaMKII)的調節[13]，該蛋白的表達與caspase-3的激活等凋亡進程也密切相關[14]。眾多研究表明，1,25-D3-MARRS蛋白調節細胞的生長需要鈣的參與。本研究顯示，在各組人系膜細胞的胞膜、胞核及胞質中均有1,25-D3-MARRS蛋白的表達，且主要表達在細胞膜上，這與既往研究[3,15]相符。通過觀察1,25-D3-MARRS蛋白定量的表達結果發現：與對照組比較，低鈣作用下1,25-D3-MARRS的表達升高;高鈣作用下1,25-D3-MARRS的表達降低，mRNA水平也是如此，結合CCK-8結果提示：隨著系膜細胞抑制率的增加，1,25-D3-MARRS蛋白表達升高，由此推測，低濃度Ca2+可能是通過促進1,25-D3-MARRS蛋白的表達來抑制系膜細胞的增殖，而高濃度Ca2+相反，但該結論仍需進一步的干預實驗進行驗證。

綜上所述，低濃度鈣可能是通過上調1,25-D3-MARRS蛋白的表達來抑制人腎小球系膜細胞的增殖，而高濃度鈣是否可以隨著濃度變化調節1,25-D3-MARRS的表達尚待研究，鈣對細胞生長的調控也受多種因素的影響，如細胞類型、胞外刺激的濃度及持續時間、不同的凋亡信號通路等，因此該結論仍需更多的干預實驗進一步驗證。若該結論得到進一步證實，或成為阻礙慢性腎臟病病程進展的重要靶點。通過分子靶向藥物上調1,25-D3-MARRS蛋白的表達來抑制系膜細胞的增殖，從而可能阻礙腎小球腎炎的進一步發展。