CD8+CD28-調節性T細胞及血小板特異性自身抗體在免疫性血小板減少癥中的表達

張小俠，張美玲，楊明珍

免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia，ITP) 是以血小板(platelet, PLT)減少、巨核細胞增加且成熟障礙、皮膚黏膜出血為特征的自身免疫性疾病[1-2]。既往研究[3]表明ITP主要發病機制是PLT特異性自身抗體介導的PLT破壞，常見類型是抗血小板膜糖蛋白(glycoprotein,GP)IIb/IIIa和抗GPIb抗體。深入研究[4-5]發現調節性T細胞(regulatory T cell, Treg)及其相關細胞因子表達異常也參與ITP發病機制。研究[6]表明清除小鼠體內CD8+CD28-Treg會加劇PLT降低，輸注富含CD8+CD28-Treg的CD8+T細胞可升高PLT，延緩小鼠ITP疾病進展。但人ITP中CD8+CD28-Treg的表達變化和作用機制尚不清楚。激素是ITP治療一線用藥，效果顯著，但副作用大且部分患者無效。重組人血小板生成素(recombinant human thrombopoietin, rhTPO)為ITP治療的二線用藥，療效已有研究[7]證實，但停藥后，PLT易回落，不能維持療效。該實驗檢測患者治療前后CD8+CD28-Treg及細胞因子的表達，分析CD8+CD28-Treg及細胞因子在ITP發病及臨床治療中的意義，檢測治療前PLT自身抗體的表達，分析抗體種類與臨床用藥療效的關系。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2017年2月～2018年11月安徽醫科大學第一附屬醫院門診和住院治療的初診ITP患者73例。其中男27例，女46例，年齡16～82歲，中位年齡47歲，超過40歲者25例，PLT計數≤10×109/L者41例，均符合ITP診斷標準。患者臨床資料見表1。正常對照組30例，均為同時期健康體檢者，男12例，女18例，年齡22～68歲，中位年齡38歲。

1.2 療效判定標準參考文獻[8]：① 完全反應：治療后PLT≥100×109/L，無出血癥狀。② 有效：治療后 PLT>30×109/L，比基礎PLT計數增加至少2倍、無出血癥狀。③ 無效：治療后PLT≤30×109/L，PLT計數增加不到基礎值的2倍或有出血癥狀。

表1 ITP患者臨床資料[n(%)]

1.3 主要試劑與器材別藻藍蛋白抗體(APC)標記的小鼠抗人CD28單克隆抗體(mAb) 、異硫氰酸熒光素(FITC)標記的小鼠抗人CD8 mAb、藻紅蛋白-德州紅-X(ECD)標記的小鼠抗人CD3 mAb、溶血劑、破膜劑、流式細胞儀均購自美國BD公司。Coul-terlh750型血細胞自動計數儀購自美國Beckman公司。轉化生長因子(transforming growth factor, TGF)-β1、白介素(interleukin, IL)-10和干擾素(interferon, IFN)-γ ELISA試劑盒購于武漢ABclonal公司。ITP抗血小板抗體檢測試劑盒購自常州福隆生物有限公司。

1.4 主要實驗方法

1.4.1CD8+CD28-Treg檢測 采集ITP患者治療前、治療后及健康對照者外周肝素抗凝血6 ml。2 ml 2 500 r/min離心10 min，收集無溶血血清標本，-80 ℃冰箱凍存，用于細胞因子檢測。50 μl抗凝血中加入抗人CD3-ECD、CD8-FITC、CD28-APC單克隆抗體各5 μl,避光孵育15 min,再加入紅細胞裂解液500 μl,振蕩后混勻,避光孵育10 min。1 500 r/min離心5 min,棄上清液，加入1 ml PBS后以1 500 r/min離心5 min，棄上清液，用800 μl PBS重懸浮后上流式細胞儀檢測。

1.4.2血小板特異性自身抗體檢測及血小板制備 采集標本1 400 r/min離心5 min，分離富血小板血漿(platelet rich plasma, PRP)，取PRP，再5 400 r/min離心2 min，棄上清液，下層沉淀為PLT，PLT用800 μl血小板洗滌液洗滌3次，-20 ℃保存(時間：2周)；向PLT中加入110 μl裂解液震蕩混勻后室溫搖床裂解30 min，5 400 r/min離心20 min；取上清液100 μl到另一EP管，加入已經包被5種不同單抗的微球混合液50 μl，震蕩混勻，室溫避光孵育1 h；加入600 μl微球洗滌液，3 800 r/min離心20 min，輕輕吸取上清液，底部約留100 μl殘留液；再加入FITC標記的羊抗人IgG多克隆抗體10 μl，震蕩混勻。室溫避光孵育30 min；加入600 μl微球洗滌液，3 800 r/min離心20 min，輕輕吸取上清液，底部約留100 μl殘留液，加入500 μl微球洗滌液，上機檢測；在使用前，按照本實驗方法用3份正常人PLT作為陰性對照實驗，以確定本實驗室的臨界值。

1.4.3檢測細胞因子TGF-β1、IFN-γ和IL-10含量 采用ELISA法檢測，按有關試劑盒說明書進行操作。

1.4.4治療方法 激素組患者應用糖皮質激素治療，給予地塞米松40 mg/d，連用4 d，或甲潑尼龍1～2 mg/(kg·d)，至PLT達到(80～100)×109/L后改為潑尼松1 mg/(kg·d)口服。rhTPO組患者皮下注射rhTPO注射液，劑量300 U/(kg·d)，療程14 d。若未達14 d，當PLT≥100×109/L，停止給藥。

2 結果

2.1 對照組及ITP患者治療前后CD8+CD28-Treg及細胞因子的表達結果

2.1.1對照組與患者治療前CD8+CD28-Treg及細胞因子的表達結果比較 ITP患者治療前CD8+CD28-Treg低于正常對照組，細胞因子IL-10、TGF-β1的表達低于正常對照組，IFN-γ的表達高于正常對照組，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 對照組及ITP患者治療前CD8+CD28- Treg及細胞因子的表達

與對照組比較：*P<0.05

2.1.2有效組治療前后CD8+CD28-Treg及細胞因子的表達結果比較 激素及rhTPO治療后CD8+CD28-Treg的表達均較治療前上升，細胞因子IL-10、TGF-β1的表達均較治療前增加，IFN-γ的表達均較治療前下降，治療前和治療后比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。CD8+CD28-Treg的流式表達圖例見圖1。

2.1.3無效組治療前后CD8+CD28-Treg及細胞因子的表達結果比較 激素及rhTPO治療后CD8+CD28-Treg、IFN-γ、IL-10、TGF-β1的表達和治療前相比均未出現明顯變化，治療前和治療后比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表4。

2.2 ITP患者治療前CD8+CD28-Treg的表達對療效預測的意義根據有效組和無效組患者治療前所測CD8+CD28-Treg的值，繪制ROC曲線，分析CD8+CD28-Treg對臨床用藥療效的預測作用。激素組治療前CD8+CD28-Treg的臨界值為14.35，曲線下面積(area under curve, AUC)為0.74(P<0.05)，95%CI：0.575～0.904。此時預測激素療效的敏感性和特異性為66.7%和73.3%，27例治療有效者中，CD8+CD28-Treg小于14.35的有18例(66.7%)，15例無效者中大于14.35的有11例(73.3%)，見圖2。rhTPO組治療前CD8+CD28-Treg的臨界值為15.45，AUC為0.75(P<0.05), 95%CI：0.560～-0.940。此時預測rhTPO療效的敏感性和特異性為63.6%和88.9%。22例治療有效者中，CD8+CD28-Treg大于15.45的有14例(63.6%)，9例治療無效者中小于15.45的有8例(88.9%)，見圖3。上述結果提示CD8+CD28-Treg有可能作為患者療效預測的指標之一。

2.3 血小板特異性抗體的表達結果激素組抗GPⅡb/Ⅲa抗體陽性患者17例，有效10例，無效7例。GPⅡb/Ⅲa抗體陰性患者25例，有效17例，無效8例。兩組比較差異無統計學意義( χ2=0.371,P>0.05)。抗GPIb抗體陽性患者18例，有效8例，無效10例，抗GPIb抗體陰性患者24例，有效19例，無效5例，差異有統計學意義 (χ2=5.401,P<0.05)。 rhTPO組抗GPⅡb/Ⅲa抗體陽性患者11例，有效7例，無效4例，抗GPⅡb/Ⅲa抗體陰性患者20例，有效15例，無效5例，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。抗GPIb抗體陽性患者13例，有效7例，無效6例，抗GPIb抗體陰性患者18例，有效15例，無效3例，差異無統計學意義(P>0.05)。見表5、6和圖4。

表3 激素及rhTPO有效組治療前后CD8+CD28- Treg及細胞因子的表達

與激素治療前比較：*P<0.05；與rhTPO治療前比較：#P<0.05

圖1 CD8+CD28-Treg流式細胞表達圖

組別nCD8+CD28- Treg(%)TGF-β1(pg/ml)IL-10(pg/ml)IFN-γ(pg/ml)激素組治療前1516.62±4.041 004.88±201.9514.04±2.2397.07±15.68激素組治療后1516.78±4.911 103.98±276.7713.03±2.0190.11 ±16.72rhTPO組治療前913.20±3.411 015.95±252.8511.93±2.5995.26±14.27rhTPO組治療后917.37±4.621 113.49±161.2313.64±2.5792.59±15.27

圖2 激素組治療前CD8+CD28- Treg的變化在ROC曲線中的表現

表5 激素組血小板特異性抗體表達類型和療效的關系(n)

與B組比較：*P<0.05

圖3 rhTPO組治療前CD8+CD28- Treg的變化在ROC曲線中的表現

表6 rhTPO組血小板特異性抗體表達類型和療效的關系(n)

3 討論

ITP是出血性疾病中最為常見的一種，約占出血性疾病的30%。ITP發病機制文獻報道眾多，涉及多個方面，其可能與多種病理因素引起的體液免疫和細胞免疫異常有關。課題組前期研究[9]表明ITP患者外周血中存在CD8+T細胞亞群及樹突狀細胞亞群的改變。且在部分糖皮質激素無效的患者中比例較對照組下降，提示CD8+T細胞中除具有免疫殺傷作用外，應還具有類似Treg的功能，CD8+CD28-Treg是CD8+T細胞的重要組成部分，通過細胞檢測發現CD8+CD28-Treg的受體多樣性降低，端粒變短，抗原誘導增殖的能力減弱，分化能力降低，細胞毒性減弱或消失[10]。目前認為CD8+CD28-Treg主要通過細胞與細胞之間直接接觸或者分泌相關細胞因子如IL-10、TGF-β1、IFN-γ等發揮其免疫調節功能[11]。有研究[12]報道該類細胞在炎癥、腫瘤、自身免疫病等發病過程中起到了重要的作用。

圖4 流式微球檢測結果圖

本研究顯示ITP患者治療前CD8+CD28-Treg及細胞因子IL-10、TGF-β1的表達低于正常對照組，IFN-γ的表達高于正常對照組,說明在ITP患者中存在CD8+CD28-Treg及相關細胞因子的表達異常。激素和rhTPO治療后有效患者CD8+CD28-Tregs、IL-10、TGF-β1的表達明顯增加，INF-γ的表達降低。治療后無效患者改變不大，說明激素和rhTPO可能通過調節CD8+CD28-Treg及細胞因子在ITP患者體內的表達發揮療效。通過繪制治療前CD8+CD28-Treg與療效的ROC曲線分析得知，通過檢測治療前 CD8+CD28-Treg的比例可以預測激素及rhTPO的療效，為臨床治療提供參考作用。

有研究[13]顯示，約60% ITP患者外周血中能檢測出血小板特異性自身抗體，其中最重要的組成部分是抗GPⅡb/GPⅢa抗體和抗GPIb抗體。兩種抗體也可同時存在于部分患者。本實驗顯示，抗GPIb抗體陽性患者使用激素治療的療效不佳。而抗GPⅡb/Ⅲa抗體是否陽性，激素治療效果差異不大，分析原因可能是兩種抗體導致PLT減少的機制不同。GPⅡb/GPⅢa屬于整合素家族，具有聯接PLT與纖維蛋白原的功能，與PLT特異性GPⅡb/GPⅢa抗體結合后形成抗原-抗體復合物，通過Fc受體單核巨噬細胞系統識別抗原-抗體復合物破壞血小板。GPIb屬于富含亮氨酸家族蛋白，可結合血管假性血友病因子介導血小板黏附，與抗體結合之后會通過非Fc受體依賴途徑引起血小板破壞[13-14]。建議對抗GPIb陽性患者避免應用激素等以網狀內皮系統的Fc受體為主要作用靶點的治療方法。

綜上所述，ITP患者存在CD8+CD28-Treg及其相關細胞因子的表達異常，激素和rhTPO可能通過調節CD8+CD28-Treg及其相關細胞因子的表達來發揮療效。CD8+CD28-Treg有可能作為激素及rhTPO的療效預測指標之一，同時對抗GPIb抗體陽性的ITP患者采取非激素治療，可能取得更好的治療效果。后續可以納入以丙球、利妥昔單抗等用藥作為治療方案的ITP患者作為實驗組，進一步探究CD8+CD28-Treg及PLT特異性抗體在其臨床治療中的意義，為臨床的個體化治療提供參考依據。