T細胞急性淋巴細胞白血病中NOTCH1突變與地塞米松耐藥相關性

謝蓓蓓，李麗麗，夏瑞祥

急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是一種發生在B細胞系或T細胞系的未成熟淋巴細胞或淋巴祖細胞的血液造血系統惡性疾病，在生物學特征、臨床特征及預后等方面具有很大異質性，其中T細胞急性淋巴細胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL)約占成人ALL的15%[1]。目前對成人T-ALL患者的治療主要采取化療和異基因造血干細胞移植，但總體預后較差，化療抗性為原因之一。該研究通過高通量測序及體外藥敏方法檢測54種白血病相關基因及81種化療藥物敏感度，尋找耐藥相關基因，并初步分析該基因臨床特征。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2016年10月～2018年1月就診于安徽醫科大學第一附屬醫院血液科的初診T-ALL患者38例，其中男21例，女17例，年齡在16～80(50.50±15.59)歲，中位年齡50歲，所有T-ALL患者診斷及分型均符合張之南 等[2]主編的《血液病診斷及療效標準》。初診治療前抽取外周靜脈血4～8 ml行高通量測序及體外藥敏試驗。成人T-ALL 患者均使用 VDCLP或VICLP方案治療，化療1個療程后復查骨髓判斷療效。

1.2 方法

1.2.1細胞分離及培養方法 Ficoll密度梯度離心法分離樣本，預熱淋巴細胞分離液和細胞培養液RPMI 1640至室溫，將淋巴細胞分離液加入離心管中，取2倍量的Hank′s液或RPMI 1640與肝素抗凝靜脈血充分混勻，疊加于分層液面上，常溫水平離心1 350 r/min、30 min,吸取離心后中間層中單個核細胞，加入5倍體積的Hank′s液或RPMI 1640，1 500 r/min離心10 min，洗滌細胞2次。末次離心后，棄上清液，加入含20%胎牛血清的RPMI 1640，重懸細胞。取重懸的細胞懸液10 μl, 加入80 μl RPMI 1640培養基、10 μl臺盼藍染液充分混合后，死細胞可被染成藍色，活細胞不著色。

1.2.2高通量測序方法 分離提純的單核細胞進行DNA抽提，NanoDrop鑒定純度。DNA與探針混合后加溫至95 ℃、1 min，再讓樣本探針緩慢降溫到40 ℃。除未雜交上的探針，延伸并連接雜交上的探針行PCR擴增。采用AMPure XP 純化PCR完成后的產物并進行質控，上機檢測。共檢測54個白血病相關基因，見表1。

1.2.3體外藥敏試驗方法 按照1×105～1×106個細胞/ml在細胞加樣槽中充分混勻后進行培養，每孔細胞數目為5×103～5×104/個。分別對每孔加入0.1 μl所測藥物，培養箱中孵育72 h后，加入10 μl CellTiter-Glo 細胞增殖熒光檢測試劑，靜置10 min，Envision Plate-Reader讀數。藥物名稱見表2。

表1 54種基因檢測列表

表2 81種體外藥物檢測列表

1.3 統計學處理采用SPSS 23.0進行統計學分析，計數資料采用χ2檢驗，計量資料中非正態分布數據以中位數表示，采用非參數檢驗，均以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高通量測序結果在38例成人T-ALL患者中，NOTCH1突變率最高，NOTCH1突變有18例，占47.3%，總共發現18個突變，其中13個點突變，4個缺失突變，1個插入突變。在18例NOTCH1陽性患者中，其中14例存在點突變，4例存在缺失突變，1例存在插入突變。余20例患者未發現NOTCH1突變，見表3。

表3 18例NOTCH1基因突變患者突變類型及突變位點

2.2 體外藥敏結果對38例患者行88種藥物體外藥敏試驗發現，地塞米松耐藥性高，在地塞米松濃度為3.3 μmol/L時，19例患者對地塞米松耐藥，其中NOTCH1陽性者占13例，陰性者占6例，地塞米松濃度為1.1 μmol/L時，21例患者對地塞米松耐藥，其中NOTCH1陽性者占14例，陰性者占7例，地塞米松濃度為0.37 μmol/L時，22例患者對地塞米松耐藥，其中NOTCH1陽性者占16例，陰性者占6例，不同濃度下，NOTCH1突變組與非突變組在地塞米松敏感性兩組結果之間差異均有統計學意義(P=0.002、P=0.011、P<0.001)。見表4。38例患者臨床化療方案為長春新堿1.4 mg/m2第1、8、15、22天+柔紅霉素40 mg/(m2·d)第1～3天+環磷酰胺750 mg/m2第1～3天+左旋門冬酰胺酶6 000 IU/m2第11、14、17、20、23、26天+地塞米松0.15 mg/(kg·d)第1～28天(第15天后逐漸減量)(VDCLP)或長春新堿1.4 mg/m2第1、8、15、22天+去甲氧柔紅霉素8 mg/(m2·d)第1～3天+環磷酰胺750 mg/m2第1～3天+左旋門冬酰胺酶6 000 IU/m2第11、14、17、20、23、26天+地塞米松0.15 mg/(kg·d)第1～28天(第15天后逐漸減量)(VICLP)，在18例NOTCH1突變組患者中，CR 15例，非CR 113例，20例NOTCH1非突變組患者，CR 116例，非CR 14例，兩組間差異有統計學意義(P=0.003)。體外藥敏試驗與實際臨床緩解率之間差異無統計學意義(P<0.05)。

表4 NOTCH1突變與不同濃度地塞米松敏感性相關性

2.3 NOTCH1突變患者臨床特征18例NOTCH1突變組中，男性9例，女性9例，20例NOTCH1非突變組中，男性12例，女性8例，性別差異無統計學意義(χ2=0.383，P=0.438)，NOTCH1突變組與非突變組的年齡、初診時白細胞計數、骨髓原始細胞數、血紅蛋白、LDH水平差異無統計學意義(P>0.05)，血小板計數差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

3 討論

成人急性淋巴細胞白血病預后相對較差，對糖皮質激素耐藥是引起兒童及成人預后差異的重要原因之一[3]，糖皮質激素(glucocorticoid，GC)是T-ALL治療中的重要化療藥物，貫穿于T-ALL治療的整個過程，糖皮質激素通過與激素受體(glucoticoid receptor，GR)結合后進入細胞核內，啟動下游凋亡途徑來發揮誘導白血病細胞凋亡和溶細胞作用[4]，但其耐藥機制目前尚未完全明確。NOTCH1是一種Ⅰ型膜蛋白受體及配體激活型轉錄因子，最初認為是以B細胞發育為代價指導T細胞譜系定型所必需[5]，T細胞惡性腫瘤幾乎都有NOTCH信號通路的活化[6]，如今已經發現了其對T細胞白血病中的致癌潛力[7-8]。在NOTCH1信號傳導途徑中，當配體與其細胞外結構域結合時，NOTCH1跨膜受體被激活，首先引起兩個連續的蛋白水解切割事件，進而通過激活PI3K-AKT-mTOR通路、NOTCH1-cMYC信號通路、NF-κB通路等導致T-ALL的發生[9-13]。

表5 NOTCH1突變與各因素相關性[M(P25，P75)]

為了解NOTCH1突變是否引起化療抗性，本研究對所有患者行體外藥敏試驗，結果提示18例NOTCH1突變患者對三種不同濃度的地塞米松均表現出耐藥性，0.37 μmol/L時有16例對地塞米松耐藥，1.1 μmol/L時有14例對地塞米松耐藥，3.3 μmol/L時有13例對地塞米松耐藥，由此可見NOTCH1突變可引起對化療藥物地塞米松耐藥。

目前有大量臨床系列研究分析了NOTCH1突變與臨床預后的相關性，大多數的研究認為NOTCH1基因突變的T-ALL預后較好，本研究顯示，NOTCH1突變組的18例患者中，有5例獲得CR1，13例未達到CR1，無NOTCH1突變組的20例患者中，有16例獲得CR1，4例未達到CR1，突變組CR1率明顯低于非突變組，差異有統計學意義(P<0.05)，提示NOTCH1基因突變可能為預后不佳指標。劉卉 等[14]研究顯示， NOTCH1突變組患者2年累積總生存率和無事件生存率低于無突變者，突變組的復發率高于非突變組，本研究結果與之相似。

進一步分析NOTCH1突變組的臨床特征可見，NOTCH1突變組和非突變組的年齡、性別、初診時白細胞計數、骨髓原始細胞數、血紅蛋白、LDH差異均無統計學意義，血小板計數差異有統計學意義，NOTCH1突變組患者具有更低的血小板計數，本研究結果顯示NOCTH1突變未引起高腫瘤負荷，但可導致血小板計數降低，可能帶來較大的出血風險。

本研究結果提示，NOTCH1突變可引起對地塞米松耐藥，引起較差的治療效果，針對該類患者據體外藥敏結果行精準醫療有望改善預后。由于本研究樣本量較少，后期可通過擴大樣本量進一步核實NOTCH1突變與地塞米松耐藥之間相關性，并建立動物模型了解耐藥發生機制，尋找阻斷耐藥方法。