CD16+單核細胞對冠心病患者OPCABG術后預后的預測價值

朱 瑞，張成鑫，王會平，李 鑫，沈志明，孫 飛，儲誠豪，葛圣林

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease, CHD)近年來在外科治療策略上獲得了極大的進展，尋找能夠獨立預測CHD患者術后預后的預測因子對術前危險分層評估具有重要意義[1]。單核細胞在CHD的發生和進展過程中扮演關鍵角色，血液中單核細胞黏附于活化的血管內皮細胞，經內皮間隙浸潤至內膜下分化為巨噬細胞，巨噬細胞吞噬內膜下脂質形成泡沫細胞和脂質斑塊，激活先天性和適應性免疫反應[2]，繼而表達一系列炎癥因子與基質金屬蛋白酶，導致粥樣斑塊的不穩定性和血管再狹窄[3]。研究表明CHD進展伴隨著外周血經典單核細胞向CD16+單核細胞亞群的轉變[4]，而中間型單核細胞(CD14++CD16+)增多與CHD患者主要不良心血管事件(major adverse cardiovascular events,MACE)密切相關[5]。該研究旨在分析CD16+單核細胞對接受非體外循環冠狀動脈旁路移植術(off-pump coronary artery bypass grafting,OPCABG)CHD患者術后預后的預測價值，為術前評估預后危險分層提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取安徽醫科大學第一附屬醫院心臟大血管外科接受OPCABG的CHD患者168例，術中因個體原因轉為體外循環下冠狀動脈旁路移植術(CABG)7例，2年隨訪期間5例失訪，因非心源性死亡1例。最終符合本研究并完成隨訪過程155例，男125例，女30例，年齡47～75(62.87±5.57)歲。診斷標準及手術指征依據《2011版ACCF/AHA關于外科冠狀動脈旁路移植治療指南》。排除標準：① 術前存在感染或炎癥疾病病史；② 自身免疫疾病病史；③ 血液疾病或惡性腫瘤病史；④ 既往血運重建史或其他手術后；⑤ 既往服用過激素；⑥ 合并瓣膜病、原發性心肌病、嚴重心力衰竭或腦血管疾?。虎?肝腎功能不全；⑧ 術中轉為CABG；⑨ 因非心源性死亡；⑩ 無法提供知情同意。本研究獲安徽醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準，符合《赫爾辛基宣言》，納入此研究患者均已簽署知情同意書。

1.2 臨床資料登記登記患者基本臨床資料及術前常規化驗指標，包括年齡、性別、體質量指數(body mass index, BMI)、高血壓、糖尿病、腦血管病史、吸煙史、家族史、既往服用藥物史、左心房前后徑(left atrial diameter, LAD)、左心室舒張末內徑(left ventricular end diastolic diameter, LVEDD)、左心室射血分數(left ventricular ejection fraction, LVEF)、血常規、肝腎功能、血脂四項、血糖、C-反應蛋白(C-reaction protein, CRP)等。

1.3 單核細胞亞群流式細胞術檢測術前采集患者外周靜脈血3 ml于肝素抗凝管，3 h內行流式細胞術檢測。取兩支流式管加入血樣本100 μl，一管加入抗體CD14-FITC、CD16-PE和CD45-PC5各10 μl，另一管為對照管，加入對應同型對照抗體10 μl，震蕩搖勻后室溫下避光15 min；每管再分別加入溶血劑900 μl，震蕩搖勻后37 ℃水浴箱避光10 min；采用Beckman CytomicsTMFC-500系列流式細胞儀檢測。檢測前進行光流路質量調控和熒光補償，控制各項指標在質量允許值范圍內。每份標本檢測獲取細胞10 000個以上，檢測數據以Listmode文件形式保存，采用CXP 流式分析軟件進行數據分析。通過白細胞共同分化抗原CD45、單核細胞標志性脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS)受體CD14、FcγⅢ受體CD16對單核細胞群進行分析[6]，根據前向角(FSC)、側向角(SSC)及CD45表達強度確定單核細胞群，再采取同型對照確定CD14與CD16表達強度的界值，將單核細胞分為經典型(CD14++CD16-)、CD16+單核細胞2種單核細胞子集。根據本研究CHD患者CD16+單核細胞占比的三分位數進行分組，低CD16+單核細胞組51例(≤32.05%)、中CD16+單核細胞組53例(32.05%～40.1%)和高CD16+單核細胞組51例(>40.1%)。

1.4 隨訪患者術后隨訪2年，以發生MACE作為此項研究隨訪觀察的終點，計算并登記發生MACE距手術當天的時間。MACE定義：心源性死亡、再發心絞痛或心肌梗死、心力衰竭、非出血性卒中、隨訪期間需再次進行冠狀動脈血運重建[非預期經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention, PCI)或CABG]。

2 結果

2.1 患者基線特征比較入選CHD患者155例中男125例(80.6%)，女3例(19.4%)，年齡47～75(62.87±5.57)歲。術后發生MACE的患者24例，其中心源性死亡10例，再發心肌梗死4例，心力衰竭7例，非出血性卒中2例，需再次行手術進行血運重建1例。MACE組年齡較大(P<0.001)，糖尿病史較多(P<0.05)，術前LVEF較低(P<0.001)，而CRP值及CD16+單核細胞占比較高(P<0.001)，術后呼吸機輔助時間與ICU停留時間均較長(P<0.001)。見表1。

2.2 CD16+單核細胞三分位組比較流式檢測外周血CD16+單核細胞占比，W2象限為CD16+單核細胞，見圖1。高CD16+單核細胞組患者術前CRP(P<0.001)、術后ICU停留時間(P<0.05)及MACE發生率(P<0.001)均高于中、低CD16+單核細胞組，見表2。Kaplan-Meier生存分析顯示高CD16+單核細胞組術后MACE發生率(33.3%)明顯高于中(9.4%)、低CD16+單核細胞組(4.0%)，差異有統計學意義(Log Rank=21.960，P<0.001)，見圖2。

2.3 CD16+單核細胞對MACE的預測價值通過單因素Cox比例風險模型對影響CHD患者術后預后的因素進行分析，結果表明年齡、CRP、LVEF、呼吸機輔助時間、ICU停留時間和CD16+單核細胞占比與術后MACE發生相關(P<0.05)。經多因素Cox比例風險模型對性別、BMI、吸煙史、高血壓史、糖尿病史、家族史、CRP等傳統心血管疾病危險因素進行校正，分析結果顯示CD16+單核細胞是CHD患者OPCABG術后發生MACE的獨立危險因素(HR=1.071，95%CI：1.040～1.104，P<0.001)。見表3。

2.4 ROC曲線評估通過ROC曲線評估，CD16+單核細胞預測術后MACE的曲線下面積為0.786 (95%CI:0.687～0.884，P<0.001)，最佳截斷值41.9%，靈敏度70.8%，特異度78.6%，證明術前CD16+單核細胞占比具有較好預測CHD患者OPCABG術后MACE的價值。CD16+單核細胞預測術后MACE的ROC曲線下面積僅次于ICU停留時間(AUC=0.899，95%CI:0.841～0.958，P<0.001)，高于呼吸機輔助時間(AUC=0.753，95%CI:0.640～0.865，P<0.001)等指標。見圖3。

3 討論

CHD是由于冠狀動脈發生動脈粥樣硬化(ather-osclerosis,AS)導致冠脈狹窄或阻塞，引起心肌缺血、低氧或壞死的一種缺血性心臟病。AS本質上是一種慢性炎癥，多種免疫細胞參與了動脈粥樣斑塊的形成。人類經典型單核細胞(CD14++CD16-)占循環單核細胞池的85%，其余由中間型(CD14++CD16+)和非經典型(CD14+CD16++)組成[7]。AS初期血液中經典型單核細胞數量增加，黏附于活化的血管內皮細胞，浸潤至血管內膜下分化為巨噬細胞[8]，隨著AS的進展，經典型單核細胞向CD16+單核細胞亞群進行轉變[4]，最新一項研究也證實單核細胞在機體穩定期向炎癥期發展過程中經歷了從經典型(CD16-)到中間型(CD16+)和非經典型(CD16++)的順序演變[9]。Kashiwagi et al[10]研究認為CD16+單核細胞高計數表達與穩定心絞痛患者AS斑塊的脆弱性密切相關。CD16+單核細胞在心室重塑過程中也扮演了重要角色，Czepluch et al[11]發現CD16+單核細胞在CHD患者發生心肌梗死時大量轉移至梗死部位，參與心肌修復與心室重塑。

表1 MACE組與非MACE組患者基線特征比較

ACEI：血管緊張素轉化酶抑制劑；ARB：血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑；NSAIDs：非甾體類消炎藥；CCB：鈣離子拮抗劑；β-blocker:β受體阻滯劑；Statins：他汀類藥物；TC：總膽固醇；TG: 甘油三酯；LDL-C: 低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C: 高密度脂蛋白膽固醇；BUN：血尿素氮

圖1 流式細胞術檢測外周血CD16+單核細胞

A：低CD16+單核細胞組(≤32.05%)；B：中CD16+單核細胞組(32.05%～40.10%)；C：高CD16+單核細胞組(>40.10%)

表2 CD16+單核細胞三分位組臨床資料比較[M(Q1，Q3)]

圖2 CD16+單核細胞三分位組Kaplan-Meier生存分析

項目單因素Cox回歸HR(95%CI)P值多因素Cox回歸HR(95%CI)P值年齡1.148(1.048～1.257)<0.051.143(1.038～1.258)<0.05CRP1.061(1.026～1.097)<0.051.052(1.007～1.100)<0.05LVEF0.837(0.773～0.906)<0.0010.799(0.722～0.884)<0.001呼吸機輔助1.049(1.030～1.069)<0.0011.044(1.015～1.074)<0.05ICU1.012(1.007～1.017)<0.0011.016(1.009～1.023)<0.001CD16+單核細胞1.055(1.030～1.080)<0.0011.071(1.040～1.104)<0.001

圖3 CD16+單核細胞等指標預測術后MACE的ROC曲線

心血管疾病危險因素與先天性免疫系統激活引起的免疫學變化有關。單核細胞在CHD患者中表現出明顯的異質性，外周血單核細胞水平升高是CHD的獨立危險因子[12]，更有研究[13]顯示MACE患者的單核細胞基線特征改變與CHD患者相似，都表現出中間型單核細胞水平較高，經典和非經典單核細胞向中間型單核細胞轉移。Shantsila[14]指出單核細胞本質上分為CD14+CD16-與CD14+CD16+兩種具有明顯不同作用的細胞子集，CD14+CD16-單核細胞促進蛋白水解和炎癥進展，而CD14+CD16+單核細胞具有拮抗炎癥和免疫調節作用。CD16+單核細胞作為獨立的一類單核細胞子集，已被研究[10]證實可用于評估CHD患者冠狀動脈粥樣硬化斑塊的脆弱性。

研究[15]顯示在急性心肌梗死發生時中間型單核細胞(CD14+CD16+)的表達急劇升高，其表達水平與左心室心功能損傷程度及梗死面積具有一致性，同時在急性心肌梗死患者的梗死灶核心區發現了大量單核細胞聚集。在梗死區周圍聚集的單核細胞促進白細胞介素-6、腫瘤壞死因子等炎癥細胞因子釋放，在血管內皮細胞損傷、心肌細胞凋亡、心力衰竭及心室重塑等病理生理過程中具有重要作用[12]。CHD患者術前CD16+單核細胞水平增加，拮抗心肌急性缺血所致的炎癥反應，有利于心室重塑，這種過度動員的CD16+單核細胞水平反映了CHD患者術前的心肌炎癥狀態，這可能是此類患者術后易發生MACE的原因。

本研究通過分析CHD患者CD16+單核細胞亞群占比、傳統心血管疾病危險因素、在院臨床指標等與術后發生MACE的關系，表明CD16+單核細胞是CHD患者OPCABG術后MACE的獨立預測因子，對于CHD患者術前評估預后危險分層具有重要意義。