老年癡呆癥患者外周血中LncRNA-BC200和LncRNA-17A水平及應用價值

李曉峰，張文瑛，梁鐵生

老年癡呆即阿爾茲海默病(Alzheimer disease，AD)是一種起病隱匿、呈進行性發展的神經系統退行性疾病，以記憶障礙、失語、失用、失認等為主要臨床表現，嚴重影響其工作及生活，同時給家庭和社會帶來沉重負擔[1]。近年，我國人口老齡化日益嚴重，AD患病率明顯升高，成為繼心血管病、癌癥及腦卒中之后威脅我國國民生命健康的又一“殺手”，引起全社會關注[2]。但到目前為止，臨床上仍缺乏AD早期診斷和治療的有效手段。近年，隨高通量技術的不斷完善，長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)作用及功能逐漸被探究出來，成為生物學領域的研究熱點之一[3]。越來越多研究表明，lncRNA與AD、帕金森病及亨廷頓病等神經退行性疾病發生發展密切相關[4，5]。有學者研究發現，LncRNA-BC200和LncRNA-17A在AD患者腦組織中異常表達[6]。但其在外周血的表達情況及對AD患者的價值目前探究較少。本研究選取2016年1月～2018年12月于本院收治的97例老年癡呆患者和100例非老年癡呆健康體檢者作為研究對象，探討LncRNA-BC200和LncRNA-17A在老年癡呆患者外周血中的表達情況及臨床價值。

1 資料和方法

1.1 研究對象 入組標準：(1)符合美國國立神經病、語言障礙和卒中研究所-阿爾茨海默病及相關疾病協會的“很可能AD”診斷標準；(2)年齡≥65歲；(3)簡易精神狀態量表(mini-mental state examination，MMSE)評分低于最低臨界值；(4)Hachinski缺血指數量表≤4分。排除標準：(1)合并抑郁癥或病史；(2)既往有嚴重心、肝、腦、腎等內科疾病；(3)合并癌癥。遵循以上標準，共納入97例AD患者，其中男49例，女48例；年齡65～80歲，平均(71.32±6.55)歲。選取同期于本院進行體檢的性別及年齡與之相匹配的100例健康體檢者作為對照組。所有患者及家屬均簽署知情同意書，并通過本院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 LncRNA-BC200和LncRNA-17A檢測 (1)標本收集：抽取兩組患者入組后1 d空腹靜脈血5 ml于EDTA抗凝管中，4000 r/min離心10 min分離血清，并用2個新的EP管進行分裝(用于LncRNA-BC200和LncRNA-17A檢測)，于-80℃冰箱保存。(2)總RNA提取：取出EP管解凍，并向其中加Trizol試劑，顛倒混勻，后再向其中加入氯仿，劇烈震蕩，離心取上層無色液體至新EP管，加入異丙醇，混勻，離心棄上清，后加入焦碳酸二乙酯使其溶解。(3)逆轉錄制備cDNA：參考逆轉錄試劑盒操作說明書準備反應體系(10 μl)：1 μl逆轉錄酶混合液、1 μl Oligo Dt Primer、5 μl總RNA和3 μl雙蒸餾水，在PCR儀上進行變性及退火(37 ℃ 15 min～80 ℃ 10 s)；將制備的cDNA用DEPC液稀釋后保存。(4)實時熒光定量PCR：參考熒光定量PCR試劑盒說明書進行，反應體系(25 μl)：上下游引物各1.0 μl、SYBR?Premix Ex TaqTM12.5 μl、cDNA 0.5 μl和雙蒸餾水10 μl；反應條件：95 ℃ 3 min預變性、35個循環(95 ℃ 30 s變性、58 ℃ 30s退火、72 ℃ 30 s延伸)，后繪制熔解曲線分析PCR產物特異性；每孔設置3個復孔，取3孔CT平均值作為最后的CT值，以2-△△Ct表示相對表達水平其中以GAPDH為內參基因，LncRNA-BC200上下游引物分別為：5’-CTCAGGGAGGCTAAGAGGCG-3’和5’-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3’；LncRNA-17A上下游引物分別為：5’-CCACCCTGAACTGACACAT-3’和5’-GCAAAGGTGCTAATCTTGACTCTTG-3’。

1.2.2 AD患者認知功能評判標準 本研究采用MMSE評判AD患者認知功能，具體包括20個題目，涉及即刻記憶、常識、記憶、地點定向等，得分越低則提示認知功能越差。其中患者教育程度不同其判定為AD的MMSE評分不同：文盲≤17分，小學程度≤ 20分，中學程度(含中專)≤ 22分，大學程度(含大專)≤ 23分。AD嚴重程度分級：輕度認知功能障礙MMSE≥21分，中度認知功能障礙MMSE 10～20分，重度認知功能障礙MMSE≤ 9分。

2 結 果

2.1 兩組外周血LncRNA-BC200和LncRNA-17A水平比較 與對照組比較，AD組外周血LncRNA-BC200和LncRNA-17A水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)(見表1)。

2.2 外周血LncRNA-BC200和LncRNA-17A對AD的診斷價值 繪制ROC曲線發現(見圖1)，LncRNA-BC200和LncRNA-17A對AD均有一定診斷價值，兩者聯合可明顯提高診斷效能(見表2)。

2.3 外周血LncRNA-BC200和LncRNA-17A與MMSE評分的關系 經Pearson相關分析發現，外周血LncRNA-BC200和LncRNA-17A與MMSE評分均呈正相關(P<0.05)，其相關系數分別為0.725和0.684。

2.4 外周血LncRNA-BC200和LncRNA-17A與AD嚴重程度的關系 97例AD患者中，輕度認知功能障礙患者42例，中度認知功能障礙患者31例，重度認知功能障礙患者24例；外周血LncRNA-BC200和LncRNA-17A在重度、中度和低度認知功能障礙患者中依次下降，且差異有統計學意義(P<0.05)(見表3)。

組別例數LncRNA-BC200LncRNA-17AAD組對照組tP971001.89±0.421.15±0.3413.61101.56±0.351.07±0.2211.8020

表2外周血LncRNA-BC200和LncRNA-17A對AD的診斷價值分析

指標AUC95%CIP敏感度(%)特異度(%)LncRNA-BC200LncRNA-17ALncRNA-BC200+LncRNA-17A0.7510.7040.8950.723～0.7890.682～0.8370.823～0.9340.0280.042068.4962.4585.8270.1165.2388.83

圖1 LncRNA-BC200和LncRNA-17A診斷AD的ROC曲線圖

3 討 論

到目前為止，國內外缺乏診斷AD的早期敏感指標，有文獻報道，全球AD患者中僅1/3患者獲得早期診斷及干預，大部分患者確診時已處于AD晚期，給患者生活帶來極大傷害[7]。因此尋找敏感、有效、方便且經濟的診斷方法已迫在眉睫。LncRNA通常由RNA聚合酶Ⅱ轉錄而成，是一種長度超過200個核苷酸的不編碼蛋白質的核酸分子，從而被認為是“垃圾”分子[8]。近年，隨分子技術的不斷發展，LncRNA作用及生物學功能逐漸被挖掘，認為與劑量補償效應、表觀遺傳調控、細胞周期調控和細胞分化調控等眾多生命活動密切相關[9]。研究發現，LncRNA可廣泛存在于人類血液、體液及組織中，且血漿LncRNA在經過反復凍融后仍可保持穩定，而外周血標本獲取便捷、經濟，促進了血液LncRNA研究的快速發展[10，11]。近年來，越來越多表觀遺傳學研究表明，lncRNA可參與神經系統疾病的發生與發展，當其表達或功能異常，可直接或間接導致神經退行性疾病的發生[12]。

LncRNA-BC200可在人類神經細胞中特異性表達，主要通過特定調節機制參與神經元細胞突觸小體的形成，在一般正常組織中均為較低表達；但近年有研究發現，其在AD患者海馬組織中顯著高表達，且與臨床癥狀等密切相關，提示LncRNA-BC200對AD具有一定價值[13]。但尚未涉及其在AD患者外周血中的研究。在本研究中，AD組外周血LncRNA-BC200水平明顯高于對照組，從外周血水平發現了價值，后來通過繪制ROC曲線圖發現外周血LncRNA-BC200可幫助診斷AD，這與王瑤等[14]部分研究結果基本一致，再次突出了外周血LncRNA-BC200檢測對AD的價值。LncRNA-17A是近年Massone等[15]在研究中發現的一種與AD相關的新LncRNA，在AD患者腦組織中高表達，主要通過介導GABA信號通路及Aβ 產生參與AD發生發展。Wang等[16]發現LncRNA-17A通過調控SH-SY5Y細胞系的自噬和凋亡構建AD模型，從細胞水平探討了其價值，但始終未涉及其臨床相關研究。而本研究發現，AD患者外周血LncRNA-17A水平明顯高于正常體檢者，后通過ROC曲線發現其在診斷AD上具有一定價值，從臨床外周血水平初步探討了LncRNA-17A對AD患者的價值。而研究還發現與單項指標比較，LncRNA-BC200和LncRNA-17A聯合可明顯提高其診斷效能，為AD患者診療作出了一定的貢獻。認知功能障礙是AD患者主要特征之一，準確判斷認知功能障礙及嚴重程度對AD患者十分重要，但目前臨床多以MMSE等作為其判斷標準，是一種主觀性評價方案，在一定程度上缺乏客觀性[17]。本研究通過Pearson相關分析發現，外周血LncRNA-BC200和LncRNA-17A與MMSE評分均呈明顯正相關，且在重度、中度和低度認知功能障礙患者中依次下降，提示AD患者外周血LncRNA-BC200和LncRNA-17A水平越高，其認知功能障礙越嚴重，有望成為AD患者認知功能障礙評價的客觀性指標。

綜上認為，LncRNA-BC200和LncRNA-17A在AD患者外周血中異常高表達，與認知功能密切相關，兩者聯合可幫助診斷AD，為AD患者診療提供更多可能。后續可通過擴大樣本量和收集范圍進行大樣本多中心研究，提高本文結果可信度，為其推廣貢獻一份力量。