急性缺血性腦卒中患者CYP2C 19基因分型與臨床預后的相關性分析

胡 鑫，朱 清，唐曉剛，姚蓓蓓，杜雯雯，夏 鑫，曹小峰，吳明華

缺血性腦卒中具有高致殘、致死風險，長期服用抗血小板藥物是治療本病的主要有效手段。但是，近年來有越來越多的報道都指出[1]，部分卒中患者在長期規律性應用抗血小板藥物(如氯吡格雷、阿司匹林等)后，再發卒中的幾率仍較高，患者的預后并不滿意。相關學者指出[2]，一些患者在規律性應用氯吡格雷后并未產生抗血小板作用，這類患者發生了氯吡格雷抵抗?；驅W層面的研究指出[3]，人體內相關過程蛋白基因的多態性是誘發氯吡格雷抵抗的重要因素，氯吡格雷代謝基因的點位基因突變是影響氯吡格雷藥效發揮的關鍵因素。CYP2C19是參與氯吡格雷代謝所不可或缺的基因，若CYP2C19發生基因突變，將會對氯吡格雷代謝過程產生重大影響，進而影響到藥物療效。CYP2C19基因的突變等位基因多達25個，其中至少有10個點位基因突變會對酶活性表達產生影響，其中*2、*3是亞洲人CYP2C19基因突變頻率較高的兩個位點，CYP2C19*2和CYP2C19*3基因突變均為功能缺失型等位基因，即表現為降低藥物濃度的弱代謝型。本研究旨在明確CYP2C19*2和CYP2C19*3基因突變對急性缺血性腦卒中患者臨床預后的影響，以指導弱代謝型基因患者的臨床用藥，為缺血性腦卒中的抗血小板藥物治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年6月～2017年6月在本院神經內科住院治療的156例急性缺血性腦卒中患者作為研究對象。根據CYP2C19基因型檢測結果分為野生型組(GG)和突變型組(GA/AA)：野生型組80例，男36例，女44例，年齡42～83歲，平均年齡(63.36±7.60)歲，合并高血壓34例、糖尿病18例、高脂血癥36例、缺血性心臟病12例，吸煙33例、飲酒41例；突變型組76例，男32例，女44例，年齡48～80歲，平均年齡(64.69±8.56)歲，合并高血壓30例、糖尿病17例、高脂血癥27例、缺血性心臟病9例，吸煙34例、飲酒36例。兩組患者的一般資料比較，差異不具有統計學意義(P>0.05)。

入組標準：(1)符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南》[4]制定的急性缺血性腦卒中診斷標準；(2)經頭部MRI或CT檢查確診；(3)入院后口服氯吡格雷，劑量75 mg/d，持續用藥時間>1 w；(4)發病時間<14 d；(5)卒中發生后未酗酒或吸煙；(6)非心源性因素引起的腦梗死。

排除標準：(1)合并惡性腫瘤、急性胃炎胃出血、癲癇、嚴重肝腎功能不全、免疫系統疾病、嚴重感染、急性心梗、房顫者；(2)合并腦腫瘤、顱內感染、腦梗死后出血、腦出血、神經變性疾病、短暫性腦缺血發作者；(3)近6 m接受過重大手術或有重大外傷史者；(4)接受透析治療者；(5)凝血功能障礙者，或正在應用抗凝血藥物者；(6)腦靜脈血栓性梗死者；(7)入院后應用過質子泵抑制劑者。本次研究通過了醫院倫理委員會批準，患者知情同意，并簽署了知情同意書。

1.2 方 法

1.2.1 CYP2C19*2和CYP2C19*3基因型檢測 采集患者的肘正中靜脈血2 ml，以EDTA真空抗凝管保存，置于-20 ℃的冰箱中保存待檢。選用德國GIAGEN公司生產的DNA提取試劑盒，嚴格按照試劑盒上的操作說明提取血液標本基因組的DNA。使用美國Sequenom公司生產的MassARRAY iPLEX基因型分析儀及配套軟件系統進行檢測，并使用ABI公司生產的9700型PCR擴增儀，對CYP2C19*2和CYP2C19*3位點所在DNA片段進行擴增。引物設計使用Assay Design Suite軟件。

CYP2C19*2(G681A)的引物為：F5’-ACCAGAGCTTGGCATATTGTATCT-3’，R5’-GATTCTTGG-TGTTCTTTACTTTCT-3’。CYP2C19*3(G636A)的引物為：F5’-TTTCAT-CCTGGGCTGTGCTC-3’，R5’-TGTACTTCAGGGCTTGGTCAAT-3’。

1.2.2 血小板抑制率測定 兩組患者均在應用氯吡格雷1 w后進行血小板抑制率檢測，采集空腹肘靜脈血3 ml，使用EDTA真空抗凝管保存，采血后2 h內完成血小板抑制率測定。檢測方法選用血栓彈力圖法，儀器選用Haemoscope公司生產的5000型血栓彈力圖法凝血分析儀，試劑包括高嶺土、激活劑F、ADP。檢測通道包括高嶺土、激活劑F、激活劑F+ADP共3個，使用血栓彈力圖法軟件計算出血小板抑制率。根據ADP誘導的血小板抑制率，分為氯吡格雷抵抗(血小板抑制率≤40%)和氯吡格雷敏感(血小板抑制率>40%)。

1.2.3 隨訪及預后 所有患者出院后均進行為期1 y的隨訪，隨訪方式包括門診復查、再入院記錄、電話詢問等。隨訪過程中，使用改良RANKIN量表[5](mRS)對患者進行評分，用以評估患者的轉歸情況。量表根據患者癥狀嚴重程度評0～5分，完全無癥狀為0分，有癥狀但無明顯殘疾，可完成所有經常從事的工作與活動為1分；輕度殘障，不能完成所有以前從事的活動，但可獨立處理個人事務計2分；中度殘疾，處理個人事務需他人協助，但可獨立行走計3分；中度殘障，行走需要他人協作，不能照顧自己的身體需要計4分；嚴重殘障，臥床、大小便失禁，需要他人的持續照護計5分。mRS評分>2分判定為預后不良。記錄兩組患者在隨訪期間的心腦血管不良事件發生情況，包括卒中復發、短暫性腦缺血發作、心源性死亡、非致死性心肌梗死等。

2 結 果

2.1 CYP2C19突變等位基因頻率及基因型頻率 CYP2C19突變等位基因頻率及基因型頻率分布(見表1)。CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因的分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡。

2.2 CYP2C19基因型與血小板抑制率、氯吡格雷抵抗的關系 野生型組患者的平均血小板抑制率為(42.42±2.74)%，突變型組為(32.41±2.69)%，突變型組的平均血小板抑制率顯著低于野生型組(t=23.011，P<0.05)。突變型組的氯吡格雷抵抗發生率為26.32%，顯著高于野生型組的1.25%(P<0.05)(見表2)。

2.3 CYP2C19基因型與臨床預后的關系 突變型組的預后不良發生率顯著高于野生型組，卒中復發率及心腦血管不良事件總發生率也顯著高于野生型組(P<0.05)(見表3)。

表1 CYP2C19突變等位基因頻率及基因型頻率分布

表2 不同CYP2C19基因分型患者的氯吡格雷抵抗發生率比較(n)

表3 不同CYP2C19基因分型患者的預后情況[n(%)]

對兩組患者繪制無再發心腦血管不良事件的KM生存曲線，曲線顯示兩組患者隨著隨訪時間的延長，累積無再發心腦血管不良事件的生存率均呈下降趨勢；與野生型(GG)患者相比，突變型(GA+AA)患者隨訪期間累積無再發心腦血管不良事件的生存率明顯更低(P<0.05)(見圖1)。

圖1 CYP2C19不同基因型患者隨訪期間的無再發心腦血管不良事件的生存率

3 討 論

卒中是臨床常見的腦血管疾病，其包括出血性卒中與缺血性卒中兩類，且以缺血性腦卒中作為多見，約有4/5左右的卒中都為缺血性卒中[6]。缺血性腦卒中，是由各種原因引起的腦部血供障礙而導致腦組織局部缺氧、缺血、壞死，并由此引發的一組神經功能缺損臨床綜合征?；颊呖杀憩F為單側肢體癱瘓、語言功能障礙、偏身感覺障礙等。近年來，隨著我國人口老齡化進程的加劇，急性缺血性腦卒中的臨床發病率也呈現出了明顯的上升趨勢。

動脈粥樣硬化性血栓形成是急性缺血性腦卒中的主要病因，所以采取有效的抗血小板治療是本病實施二級預防的關鍵?？寡“逅幬锏膽媚軌驑O大地降低腦梗死的發病率、致殘率，但是仍有部分患者在應用抗血小板藥物后，依然達不到理想的防治效果。研究認為[7]，抗血小板藥物氯吡格雷藥效的降低可能是急性缺血性腦卒中患者卒中再發的危險因素，而氯吡格雷藥效的降低主要與藥物代謝抵抗的發生有關。由于氯吡格雷是一種前體藥物，其在進入人體后有85%會被直接酯化為活性產物而排出體外，僅有15%可經肝細胞中的CYP代謝為活性產物發揮藥效[8]。在CYP系統中，CYP2C19參與了氯吡格雷兩步代謝過程，所以CYP2C19在氯吡格雷藥物代謝過程中發揮著至關重要的作用，其是氯吡格雷進行體內活化的關鍵因素。CYP2C19存在著多種突變等位基因，其中*2和*3是亞洲人最為常見的兩個CYP2C19基因突變位點。研究已證實[9]，CYP2C19*2和CYP2C19*3均是無功能等位基因，攜帶CYP2C19*2或*3等位基因者，均為弱代謝型，氯吡格雷在其體內的血藥濃度會明顯降低，血小板聚集率會明顯增加，發生腦血管不良事件的風險也會相應增加。美國食品和藥物管理局明確指出[10]，氯吡格雷在弱代謝型(*2*3、*2*2、*3*3)患者體內的藥效將無法充分發揮，臨床應通過測定CYP2C19基因型來判斷患者是否為弱代謝型，以指導這類患者的抗血小板治療方案。本次研究結果顯示，突變型組的平均血小板抑制率顯著低于野生型組，而氯吡格雷抵抗顯著高于野生型組。這與Wang等[11]的報道結論相符，說明CYP2C19基因*2、*3位點突變，造成了CYP2C19等位基因功能缺失，降低了氯吡格雷的代謝效率，氯吡格雷的抗血小板聚集作用得不到充分發揮，引起了氯吡格雷抵抗，所以突變型組的血小板聚集抑制率明顯降低。

國內有報道指出[12]，CYP2C19基因的多態性與卒中、冠心病患者的預后存在著顯著相關性。國外有學者[13]對接受氯吡格雷治療的千余名患者進行CYP2C19基因型檢測，發現有1/3的患者都攜帶有CYP2C19功能缺失型等位基因，而這些患者的心血管死亡、心肌梗死、腦卒中風險要比非攜帶者高出50%以上，并且前者的支架內血栓形成風險超出后者2倍。郭朝群等[14]對急性缺血性腦卒中患者的CYP2C19基因型及臨床預后關系進行分析后發現，CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因攜帶者在發病后3 m、6 m的預后效果明顯比非攜帶者更差。本次研究結果也顯示，突變型組的預后不良發生率、卒中復發率及心腦血管不良事件總發生率均顯著高于野生型組，KM曲線顯示，相比野生型患者相比，突變型患者隨訪期間累積無再發心腦血管不良事件的生存率明顯更低。這一結果與前述幾篇研究報道的結論相符，說明CYP2C19*2及*3等位基因突變與急性缺血性腦卒中患者的臨床預后顯著相關，其會增加急性缺血性腦卒中患者的心腦血管不良事件發生風險，導致患者預后不良。CYP2C19存在于肝臟微粒體中，由490個氨基酸殘基組成，編碼基因位于10p24染色體，包括9個外顯子和8個內含子。在CYP2C19*2和*3基因型的外顯子發生突變時，終止密碼會明顯提前，從而提前終止蛋白質合成，促使CYP2C19失活[15]。CYP2C19活性的喪失，會直接影響氯吡格雷的活化，從而削弱氯吡格雷對血小板聚集的抑制作用，影響腦卒中治療效果，增加預后不良發生風險。另外，血小板的大量聚集，也會增加腦梗死再發、短暫性腦缺血發作、非致死性心肌梗死等不良心腦血管事件的發生風險，從而增加患者的死亡風險。

綜上所述，急性缺血性腦卒中患者的CYP2C 19基因分型與血小板抑制率、臨床預后密切相關。攜帶CYP2C19突變型基因型的患者，血小板抑制率更低，氯吡格雷敏感性越差，其會降低氯吡格雷療效，增加卒中復發及其他不良心腦血管事件發生風險，從而影響患者的臨床預后效果。