AMG 510只是攻克RAS的一小步（一）

文/謝雨禮

（謝雨禮，畢業于南開大學化學系，獲

得中國科學院上海藥物研究所博士學位，在哥倫比亞大學從事博士后研究工作。2017年4月，創辦蘇州偶領生物醫藥有限公司，致力于創新化藥的研究和開發）

回顧2019年的行業熱點，小分子藥物的熱度在免疫療法的喧囂過后似乎有所回升，其中最大的亮點就是安進公司的KRAS G12C小分子抑制劑AMG510。繼ASCO后，9月中旬，安進在巴塞羅那的世界肺癌大會（WCLC）上更新了AMG510的一期臨床數據：攜帶KRAS G12C突變的非小細胞肺癌病人中，960mg高劑量組ORR達到54%，疾病控制率100%，未見明顯毒副反應。考慮到這些病人都是經過重度治療的，這個數據算是比較亮麗的。其實，業界之所以感到興奮，可能并不是因為這個數據有多好，而是RAS這個被認為不可成藥的“致癌基因之王”，經過30年努力，其直接抑制劑第一次接近成功。

RAS是第一個被發現的人類腫瘤基因（oncogene）

為什么RAS在腫瘤中這么重要？這可能還得從腫瘤生物學的起源說起。19世紀末，巴斯德等巨匠的研究讓現代醫學在抗感染領域獲得巨大成功。1876年，一個俄國人成功地將腫瘤組織從一只狗移植到另外一只狗。1908年，兩個丹麥科學家發現，母雞白血病細胞中的提取物可以讓其他鳥類感染白血病。這些觀察和研究讓人們相信腫瘤也是病毒所致的傳染病。1910年，洛克菲勒研究所的Peyton Rous從一只來自紐約長島的母雞中發現了第一個腫瘤病毒Rous Sarcoma Virus（RSV，勞氏肉瘤病毒）。此后，一系列導致動物腫瘤的RNA和DNA病毒相繼被發現。致病機理也得到了合理的解釋：這些病毒（RNA病毒通過逆轉錄酶）可以將腫瘤基因整合到被感染的宿主細胞中，誘導惡變并維持腫瘤細胞的無限分裂。發現RSV的Peyton Rous和發現RNA病毒逆轉錄酶的Howard Temin分別獲得1966年和1975年的諾貝爾生理學或醫學獎。至此，人們深信腫瘤是一種病毒導致的疾病。

直到1974年，UCSF的J. Michael Bishop和他的博士后Harold Varmus通過DNA探針意外發現未被感染的正常細胞中也存在此前RSV病毒中發現的腫瘤基因SRC。原來，腫瘤基因早就存在于宿主的基因組當中，遠古時期，病毒從宿主細胞中獲得這些基因片段并加以改造，也就是說，病毒所攜帶的腫瘤基因其實來自我們自身。這些發現打開了以基因變異為基礎的現代腫瘤生物學的大門。Bishop和Varmus也因此在1989年獲得了該領域的第三個諾貝爾獎。

Harvey和Kirsten等人在20世紀60年代分別發現了類似于RSV的逆轉錄病毒攜帶的老鼠腫瘤基因Hras和Kras。1982年，Weinberg等實驗室在人類膀胱癌細胞T24/EJ中也發現了HRAS，使得RAS成為第一個被發現的人類腫瘤基因。50多年過去后，RAS基因被發現是腫瘤中最常見的突變基因之一，30%的腫瘤攜帶RAS變異，如果算上RAS調控因子和信號通路上下游的變異，幾乎覆蓋所有腫瘤，RAS變異每年造成100萬以上的病人死亡，無愧是“腫瘤基因之王”。這也令人非常好奇，RAS到底具有什么神奇功能，令腫瘤細胞如此依賴。

RAS與腫瘤抑制基因pRb和p53一起成為腫瘤領域難以攻克的高地

談到RAS的致癌功能，又要提起腫瘤發生機制的主要假說SMT（Somatic Mutation Theory）。該理論認為腫瘤來源于正常細胞，基因突變的驅動下，獲得生存優勢，不斷進行適者生存的進化，最后演變成具有基因組不穩定、無限增殖和抗凋亡等十大標志的腫瘤細胞。這十大標志或者說能力都服務于腫瘤細胞的唯一目標：無限復制而獲得永生。細胞的復制開始于休止期（G0），接收生長因子信號的刺激后，啟動分為四個階段（G1、S、G2和M）的細胞分裂周期。在這個周期中，母細胞一分為二，復制基因并均等地分配給兩個子細胞。腫瘤基因突變或者異常可以驅動生長因子信號失控，造成細胞不受控制的生長和分裂。RAS處于各種信號通路的中樞位置，下游控制的通路包括Raf、PI3K和RalGDS等。RAS在分子水平上可以調控蛋白質的合成，基因轉錄等過程；細胞水平上影響細胞形狀、生長、分化、凋亡、轉移等等。生長因子受體EGFR、FGFR，以及轉錄因子Myc的變異也能驅動腫瘤的形成，RAS既可以在這些腫瘤基因的下游傳遞放大信號，也可以反饋增強它們的致癌功能。

如果腫瘤基因突變就輕易導致腫瘤，物種進化就不會保留它們。事實上，腫瘤的發生還需要對抗腫瘤抑制基因的作用。正常細胞的生長、分裂和增殖是由復雜信號網絡所嚴格控制的。比如細胞周期中，遺傳物質復制出錯就可能被中止分裂。細胞周期中有一個重要節點叫作限制點（R point），處于G1期的中后段，細胞分裂一旦越過R點，就無法停止，即使沒有生長因子的存在，細胞分裂也會進行到底。控制這個R點的關鍵基因叫作pRb。在CDK/Cyclin的調控下，磷酸化的pRb通過控制轉錄因子E2F決定細胞周期是否可以越過R點。pRb是限制細胞不正常分裂的最重要的檢查點，自然也是至關重要的腫瘤抑制基因。與RAS一樣，幾乎所有腫瘤中，pRb的正常功能被抑制或者被破壞。另一個與pRb同等重要的腫瘤抑制基因是監控細胞健康狀態的轉錄因子p53。正常細胞一旦受到破壞，p53會中止細胞的生長和分裂，啟動修復機器，如果無法修復則啟動細胞凋亡程序。生長因子失控或者是pRb功能缺失，也會導致p53介導的凋亡。大量突變和功能異常的腫瘤細胞如果希望永生，必須擺脫p53的控制，因此p53的功能喪失突變出現在三分之一的腫瘤之中，加上其相關通路的異常也是幾乎覆蓋100%的腫瘤。

這樣，RAS過度激活以及pRb和p53功能喪失成為導致腫瘤的三座大山，它們是目前發現的腫瘤中突變最多的三個基因。這也說明它們處于腫瘤細胞信號網絡的最關鍵節點上。廣義上說，絕大多數靶向藥物的靶點都處于這三個基因調節的信號通路中。俗話說擒賊先擒王，十分遺憾目前還沒有直接靶向這三個靶點的藥物出現。從生物學的角度上看，pRb和p53是腫瘤抑制基因，功能異常經常體現在蛋白缺失或者功能被抑制，難以用藥物進行干預。近年來，也有人嘗試用小分子糾正變異p53的構象，恢復其野生型的功能。相關藥物APR-246和COTI-2已進入臨床研究，但進展緩慢，有效性仍未得到驗證。乍一看，RAS相對于pRb和p53，作為異常激活的腫瘤基因，是更加理想的藥物靶點。事與愿違，經過多年的探索，RAS被認為是不可成藥靶點，攻克RAS成為制藥界的“哥德巴赫猜想”。

AMG-510與KRAS G12C復合物結構

RAS蛋白的結構、工作原理和調控機制

為什么RAS長期以來被認為不可成藥？這要從其結構，工作原理和調控機制說起。RAS主要有三個亞型HRAS、KRAS和NRAS，其中，KRAS通過RNA剪接又表達兩個不同的蛋白KRAS4A和KRAS4B。RAS蛋白是一種21kDa大小，位于細胞膜上的，擁有GTPase酶活性的鳥嘌呤核苷結合蛋白。RAS是GDP/GTP循環控制的二進制分子開關：GDP結合時處于“關”的狀態，而GTP結合則代表“開”的狀態。沒有刺激信號時，這種關開狀態的轉換非常緩慢。接收到信號后，鳥苷酸交換因子GEFs被招募到細胞膜上與RAS結合并釋放GDP。由于細胞中GTP的濃度遠高于GDP，RAS蛋白迅速結合GTP，招募其下游信號通路的效應蛋白進入“開”的狀態。在GAPs（GTPase Activating Protein）的作用下，RAS的GTPase的活性被提高上千倍，其結合的GTP被水解成GDP，RAS重新進入GDP結合的“關”的狀態，從而完成一個完整的循環。

RAS分子開關的結構基礎也得到了很好的闡釋。RAS蛋白1—166個氨基酸組成G-domain，這個結構域在各亞型中高度保守，余下的23—24個氨基酸組成高度可變區（HVR）。D-domain帶有RAS的核苷酸結合口袋，包括P-loop（殘基10—17）、Switch I（殘基30-38）和Switch II（殘基60—67）等區域。從其名字可以判斷，Switch I和II是RAS功能切換的關鍵。GTP結合的活性狀態時，GTP分子中Gamma位磷酸分別與Switch I的T35和Switch II的G60形成氫鍵，像彈簧一樣將它們拉在一起。一旦GTP被水解，Gamma位磷酸被水解掉，Switch I和II被分開，回到GDP結合的非活性構象。

從上述描述可以看出，GTP水解是淬滅RAS活性的關鍵步驟。不難想象，如果基因突變抑制了GTP水解，RAS蛋白將被鎖在激活狀態。正因為如此，RAS最常見的突變就發生在G12、G13和Q61三個位置。前面提到RAS高效水解GTP需要GAP蛋白參與，GAP與RAS結合后，將一個精氨酸（arginine）殘基伸到催化位點，協助水解，這個殘基被稱作精氨酸手指（arginine finger）。結構生物學研究表明，除了脯氨酸，G12或G13替換成任何氨基酸，立體位阻將阻礙精氨酸手指進入催化位點。Q61則是直接參與水解過程，協助定位一個水分子，穩定水解反應的過渡態。其他突變還有與GDP結合相關的氨基酸如A146。比較有意思的是，雖然各個亞型的D-domain和功能高度類似，但腫瘤中發現的RAS突變主要集中在KRAS（85%），NRAS（12%）次之，HRAS（3%）最少。最近的研究也許提供了部分解釋，他們發現KRAS4B而不是其他亞型通過HVR區域與calmodulin結合，從而抑制非經典Wnt通路，有利于保持腫瘤細胞的干性狀態。