miRNA-133 b在胃癌中的表達及預后價值分析

周曉紅，李永明，李莎，滕欣麗

1佳木斯市腫瘤醫院腫瘤科，黑龍江佳木斯154007

2佳木斯大學解剖教研室，黑龍江佳木斯154007

胃癌是全球第四大常見惡性腫瘤，也是全球腫瘤相關死亡的第二大常見原因，每年約有70萬人死于胃癌[1]。盡管胃癌的早期診斷率不斷提高，但仍有部分患者屬于進展期胃癌患者[2]。目前，進展期胃癌仍然被認為是致命性的惡性腫瘤，且其預后難以被準確地評估。因此，探尋用于胃癌個體化治療和預后評價的分子生物標志物具有重要意義。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類在動植物中廣泛存在的內源性非編碼小分子RNA，長度為18～25個核苷酸，miRNA與信使RNA（messenger RNA，mRNA）的 3'非翻譯區相結合，導致mRNA降解或轉錄后翻譯抑制，從而調控靶基因的表達[3-4]。miRNA參與腫瘤的多種生物學過程，包括增殖、分化、侵襲和凋亡等，作為原癌基因或抑癌基因在多種類型腫瘤的發生和發展中發揮著重要的作用[5]。盡管在胃癌中已觀察到多種miRNA的異常表達，但尚未確定關于胃癌的確切發病機制[6]。miRNA-133b最初被認為是心肌特異性miRNA，可以調控成肌細胞的分化、肌源性相關疾病的發生和骨骼肌的發育[7]，然而，有研究表明，miRNA-133b也表達于除心肌以外的組織中，尤其是其在非肌源性相關疾病（如心力衰竭、心臟肥大、帕金森病）中發揮著重要的作用；另外，miRNA-133b在多種腫瘤（如頭部腫瘤、頸部腫瘤、口腔腫瘤、食管鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌和結直腸癌）中的表達下調[8]。目前，關于miRNA-133b在胃癌中的表達情況與胃癌發生、發展關系的研究較少見。本研究探討了miRNA-133b在人胃癌細胞MKN-1中的表達情況及其對人胃癌細胞增殖和凋亡的影響，并分析了其在胃癌組織中的表達情況與胃癌患者臨床特征和預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月至2015年6月佳木斯市腫瘤醫院收治的胃癌患者。納入標準：①經腫瘤細胞學或組織學證實為胃癌；②行胃癌根治手術；③術前未接受過放療、化療等抗腫瘤治療；④未合并遠處轉移；⑤臨床資料完整。排除標準：①合并精神類疾病；②合并心、肺等其他臟器功能障礙；③合并自身免疫系統疾病；④存在嚴重的營養不良。根據納入和排除標準，本研究共納入80例胃癌患者，其中男45例，女35例；年齡為26～69歲，平均年齡為（58.31±10.0）歲。收集80例同一胃癌患者經手術切除的胃癌組織標本、癌旁組織（2cm＜距腫瘤切緣＜5cm）標本和正常胃黏膜上皮組織（距腫瘤切緣≥5cm）標本，標本均在外科手術室獲得，所取組織均經病理科醫師復核。將所有樣品快速冷凍于液氮中，并保存于-80℃的溫度下，以待后續檢測。收集患者的吸煙史、腫瘤直徑、浸潤深度、臨床分期（參照第7版美國癌癥聯合會標準[9]進行分期）等臨床資料。

1.2 細胞、試劑和儀器

人胃癌細胞MKN-1、人正常胃黏膜細胞GES-1均購自上海研生實業有限公司。RPMI 1640培養基購自美國Gibco公司；胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素、胎牛血清均購自浙江天杭生物科技股份有限公司；miRNA-133b模擬物（miRNA-133b mimics）、miRNA-133b陰性對照（negative control，NC）及轉染試劑、miRNA-133b及內參U6的上下游引物均購自上海吉凱基因化學技術有限公司；CCK-8試劑盒購自上海甄準生物科技有限公司；Trizol試劑、實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒和逆轉錄試劑盒均購自日本Takara公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒、B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）、B細胞淋巴瘤/白血病-2相關X蛋白（B-cell lymphoma/leukemia-2 associated X protein，BAX）、cleaved胱天蛋白酶3（cleavedcysteinyl aspartate specific proteinase 3，cleaved caspase 3）單克隆抗體和辣根過氧化物標記的羊抗鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）（二抗）均購自美國Abcam公司；酶標儀和PCR儀購自美國Bio-Rad公司；二氧化碳（CO2）培養箱購自美國SIM公司；LipofectamineTM2000轉染試劑盒購自上海恒斐生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養將人胃癌細胞MKN-1、人正常胃黏膜細胞GES-1培養于含10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素的RPMI 1640培養基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養箱中進行常規培養。

1.3.2 細胞轉染及分組轉染前24 h，用胰蛋白酶將處于對數生長期的人胃癌細胞MKN-1進行消化，以細胞培養液進行重懸并進行細胞計數，以2×105/m2的密度接種于12孔細胞培養板中，待細胞融合度達80%左右時，參照LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書中的方法將miRNA-133b mimics及miRNA-133b NC分別轉染至人胃癌細胞MKN-1，并分別作為miRNA-133b mimics組和miRNA-133b NC組，將僅加入轉染試劑LipofectamineTM2000的人胃癌細胞MKN-1作為對照組。將人胃癌細胞MKN-1轉染miRNA-133b mimics和miRNA-133b NC后繼續培養48 h，采用qRT-PCR法檢測各組細胞中miRNA-133b的相對表達量，并驗證轉染效率；繼續培養72 h，提取細胞總蛋白，用于后續實驗。

1.3.3 qRT-PCR法檢測miRNA-133 b的相對表達量轉染后，采用Trizol試劑按照說明書的步驟從待測的3種組織或細胞中提取總RNA。采用酶標儀檢測其濃度及質量，采用qRT-PCR反轉錄試劑盒將其反轉錄成cDNA，進行PCR。在PCR儀中進行反應擴增，PCR的反應條件：95℃30 s；95℃5 s，60℃34 s，共進行40個循環。qRT-PCR引物序列：miRNA-133b上游引物為5'-TTTGGTCCCTTCAACCA-3'，下游引物為5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'；U6的上游引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。以ABI7500實時定量PCR系統進行實驗，建立PCR產物的熔解曲線，以U6為內參基因，采用2-△△CT法分析，進行半定量比較。計算各組織和細胞中miRNA-133b的相對表達量。

1.3.4 CCK-8法檢測胃癌細胞的增殖情況取處于對數生長期的miRNA-133b mimics組、miRNA-133b NC組和對照組的人胃癌MKN-1細胞，制成細胞懸液，將細胞接種于96孔板中，每孔100 μl，接種待測細胞懸液，將培養板置于37℃、5%CO2的培養箱中預培養24 h。培養24 h后，于每孔中加入CCK-8溶液10 μl，將培養板在培養箱內繼續孵育1～4 h。使用酶標儀檢測各孔450 nm波長處的吸光度（A）值，并計算3組人胃癌細胞MKN-1的增殖情況。實驗重復3次。

1.3.5 蛋白質印跡法（Westernblot）檢測凋亡相關蛋白的相對表達量轉染后繼續培養人胃癌細胞MKN-1，培養72 h后，取 miRNA-133b mimics組、miRNA-133b NC組和對照組處于對數生長期的人胃癌細胞MKN-1，按照蛋白提取試劑盒說明書提取細胞總蛋白，采用BCA試劑盒檢測Bcl-2、BAX、cleaved caspase 3的濃度，采用Western blot法檢測各蛋白的表達情況。將上述3種蛋白與Loading buffer充分混合，100℃沸水中煮沸5 min致蛋白變性，每孔取50 μl蛋白樣品加入到十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）凝膠上樣孔中進行電泳和轉膜，5%脫脂奶粉37℃封閉1 h。加入稀釋后的一抗（稀釋濃度為1∶2000），4℃孵育過夜。TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗（羊抗鼠IgG，稀釋濃度為1∶5000），37℃孵育1 h，充分洗膜后采用電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）試劑盒曝光成像，以自動凝膠成像系統采集圖像，以β-actin作為內參，計算各蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.4 隨訪

所有患者的隨訪資料均保存完整，包括地址和聯系方式，隨訪方式為門診復查、電話隨訪，隨訪截止日期為2018年5月。觀察終點為胃癌患者死亡，定義為確診胃癌至因胃癌死亡的時間段。

1.5 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；等級資料的比較采用秩和檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存情況的比較采用Log-rank檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同細胞及組織中miRNA-133 b的相對表達量

qRT-PCR檢測結果顯示，miRNA-133b在人胃癌細胞MKN-1中的相對表達量為（0.34±0.10），明顯低于人正常胃黏膜細胞GES-1的（0.99±0.09），差異有統計學意義（t=11.834，P＜0.01）。miRNA-133b在胃癌組織、癌旁組織和胃黏膜上皮組織中的相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。miRNA-133b在胃癌組織中的相對表達量低于癌旁組織和胃黏膜上皮組織，差異均有統計學意義（P＜0.05）。miRNA-133b在癌旁組織中的相對表達量低于胃黏膜上皮組織，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

2.2 轉染后人胃癌細胞MKN-1中miRNA-133 b的相對表達量

轉染后，miRNA-133b mimics組、miRNA-133bNC組和對照組人胃癌細胞MKN-1中miRNA-133b的相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。miRNA-133b NC組人胃癌細胞MKN-1中miRNA-133b的相對表達量與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。miRNA-133b mimics組人胃癌細胞MKN-1中miRNA-133b的相對表達量高于miRNA-133b NC組和對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表2）

表1 不同組織中miRNA-133 b相對表達量的比較（±s）

表1 不同組織中miRNA-133 b相對表達量的比較（±s）

注：a與胃癌組織比較，P＜0.05；b與癌旁組織比較，P＜0.05

組織類型miRNA-133b胃癌組織（n=80）癌旁組織（n=80）胃黏膜上皮組織（n=80）F值P值0.39±0.10 0.73±0.13a 1.09±0.12a b 899.712＜0.01

表2 轉染后不同組別人胃癌細胞MKN-1中miRNA-133 b相對表達量的比較（±s）

表2 轉染后不同組別人胃癌細胞MKN-1中miRNA-133 b相對表達量的比較（±s）

注：*與miRNA-133b mimics組比較，P＜0.05

組別miRNA-133b對照組miRNA-133b NC組miRNA-133b mimics組F值P值1.02±0.08*1.01±0.09*2.39±0.31 102.570＜0.01

2.3 上調miRNA-133 b表達對人胃癌細胞MKN-1增殖能力的影響

轉染后，miRNA-133b mimics組、miRNA-133b NC組和對照組人胃癌細胞MKN-1的相對細胞存活比例比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。miRNA-133b mimics組人胃癌細胞MKN-1的相對細胞存活比例低于miRNA-133b NC組和對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。miRNA-133b NC組和對照組人胃癌細胞MKN-1的相對細胞存活比例比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（表3）

表3 不同組別人胃癌細胞MKN-1相對細胞存活比例的比較（%，±s）

表3 不同組別人胃癌細胞MKN-1相對細胞存活比例的比較（%，±s）

注：a與對照組比較，P＜0.05；b與miRNA-133b NC組比較，P＜0.05

組別相對細胞存活比例對照組miRNA-133b NC組miRNA-133b mimics組F值P值1.03±0.13 0.99±0.08 0.62±0.10a b 27.613＜0.01

2.4 上調miRNA-133 b表達對人胃癌細胞MKN-1中凋亡相關蛋白表達情況的影響

Western blot法檢測結果顯示，轉染后，對照組、miRNA-133b NC組和miRNA-133b mimics組人胃癌細胞MKN-1中Bcl-2、BAX和cleaved caspase 3的相對表達量比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。miRNA-133b mimics組人胃癌細胞MKN-1中Bcl-2蛋白的相對表達量低于對照組和miRNA-133b NC組，BAX和cleaved caspase 3的相對表達量均高于對照組和miRNA-133b NC組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表4）

表4 不同組別人胃癌細胞MKN-1中凋亡相關蛋白相對表達量的比較（±s）

表4 不同組別人胃癌細胞MKN-1中凋亡相關蛋白相對表達量的比較（±s）

注：*與miRNA-133b mimics組比較，P＜0.05

1.00±0.13*0.98±0.11*0.42±0.09 43.83 0.000 0.99±0.08*0.98±0.09*4.32±0.43 291.312 0.000 1.02±0.10*1.01±0.11*3.41±0.50 98.05 0.000對照組miRNA-133b NC組miRNA-133b mimics組F值P值組別Bcl-2 BAX cleaved caspase 3

2.5 胃癌組織中miRNA-133 b表達情況與胃癌患者臨床特征的關系

以胃癌患者胃癌組織中miRNA-133b相對表達量的中位數（0.247）為臨界值，將80例胃癌患者分為 miRNA-133b高表達（miRNA-133b＞0.247）患者27例和miRNA-133b低表達（miRNA-133b≤0.247）患者53例。不同腫瘤直徑、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移數量和TNM分期胃癌患者胃癌組織中miRNA-133b的表達情況比較，差異均有統計學意義（P＜0.01），不同性別、年齡、吸煙史胃癌患者胃癌組織中miRNA-133b的表達情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表5）

表5 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中miRNA-133 b的表達情況比較（n=80）

2.6 miRNA-133 b表達與胃癌患者預后的關系

miRNA-133b高表達胃癌患者的中位生存時間為39.1個月，長于miRNA-133b低表達胃癌患者的29.6個月，差異有統計學意義（χ2=2.514，P＜0.05）。（圖1）

圖1 miRNA-133 b高表達（n=27）和低表達（n=53）胃癌患者的生存曲線

3 討論

miRNA的異常表達參與胃癌等惡性腫瘤的發生與發展，部分miRNA作為促腫瘤因子促進腫瘤的生長，部分miRNA發揮抑制腫瘤的作用。miRNA-21、miRNA-106a等在胃癌中常過表達并促進胃癌的進展，而let-7、miRNA-101、miRNA-148和miRNA-133b等常在胃癌的發展過程中持續低表達[4]，盡管miRNA-133b最初被認為是肌肉特異性miRNA，但后來被證明可以作為包括胃癌在內的各種類型腫瘤的腫瘤抑制因子[10]。

本研究探討了miRNA-133b在胃癌中的表達情況及其與胃癌細胞增殖和凋亡的關系，結果發現，人胃癌細胞和胃癌組織樣本與人正常胃黏膜上皮細胞和胃黏膜上皮組織相比，miRNA-133b的相對表達量均降低（P＜0.05）；轉染后，與miRNA-133b NC組和對照組相比，miRNA-133b mimics組人胃癌細胞MKN-1中miRNA-133b以及BAX、cleaved caspase 3的相對表達量較高，Bcl-2蛋白的相對表達量和人胃癌細胞MKN-1的相對細胞存活比例均較低（P＜0.05）。說明上調miRNA-133b的表達可以抑制人胃癌細胞MKN-1的增殖能力，并抑制Bcl-2的表達，促進BAX、cleaved caspase 3的表達。miRNA-133b對胃癌細胞增殖的調控可能與多嘧啶束結合蛋白1（polypyrimidine tract-binding protein 1，PTBP1）有關，PTBP1是miRNA-133b的下游調控基因之一，miRNA-133b表達的上調可抑制PTBP1的表達，而PTBP1可調控腫瘤細胞的Warburg效應[11]。丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）是糖酵解過程中的關鍵酶，其中，活性最強的丙酮酸激酶M2型（pyruvate kinase M2，PKM2）是糖酵解過程中的限速酶[12]，而PKM2的表達又受到PTBP1的調控，miRNA-133b過表達可通過調控PTBP1的表達進而影響PKM2的表達和轉化，干擾胃癌細胞的糖酵解，影響胃癌細胞的增殖能力[13]。在非小細胞肺癌中，miRNA-133b可通過激活caspase 3和caspase 7依賴的凋亡途徑和誘導細胞停滯于S期從而降低肺癌細胞的存活率[14]。本研究發現，轉染后，cleaved caspase 3的表達水平升高，提示miRNA-133b對caspase 3依賴的凋亡途徑的調控可能是其影響胃癌惡性程度的重要機制之一，尋找miRNA-133b的凋亡相關下游靶點有助于揭示miRNA-133b對胃癌細胞凋亡的調控機制。

鑒于miRNA-133b在胃癌細胞增殖和凋亡方面的調控作用，本研究對miRNA-133b的表達與胃癌患者預后的關系進行了探究，結果顯示，miRNA-133b高表達患者的中位生存時間長于miRNA-133b低表達患者（P＜0.05），說明miRNA-133b表達的下調與胃癌患者的預后不良可能有關，miRNA-133b具有成為評估胃癌預后的分子標志物的潛力。有研究發現，miRNA-133b與結直腸癌的TNM分期、遠處轉移情況可能有關[15]。本研究發現，miRNA-133b的表達與胃癌的腫瘤直徑、分化程度、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移數量和TNM分期可能有關，其中，miRNA-133b的表達與淋巴結轉移數量可能有關，提示miRNA-133b可能對上皮-間充質轉化、腫瘤干細胞表型的形成等腫瘤轉移相關生物學過程具有調控作用。目前，miRNA-133b與腫瘤轉移的相關基礎研究較少，還需更多的分子生物學證據進一步證實。

綜上所述，miRNA-133b在胃癌細胞及組織中的表達下調，而上調miRNA-133b的表達可抑制胃癌細胞的增殖，并能夠影響凋亡相關蛋白的表達；miRNA-133b表達下調可能與胃癌患者的預后不良有關，其具有成為胃癌預后預測的分子標志物的潛力。miRNA-133b在細胞能量代謝和細胞凋亡中發揮著重要的調控作用，在后續的研究中，可通過生物信息學及熒光素酶報告基因實驗，尋找與細胞能量代謝和凋亡相關的miRNA-133b下游靶點，從而揭示miRNA-133b調控胃癌細胞能量代謝及凋亡過程的具體機制。另外，長鏈非編碼RNA的研究已廣泛開展，與miRNA-133b相關的長鏈非編碼RNA的篩查可能能夠為尋找胃癌預后預測的分子標志物提供新的方向。