p62蛋白在大腸癌中的表達及對大腸癌細胞生物學特性的影響

王曉明，梁國棟，王巖，楊玉波，劉峰

吉林省腫瘤醫院結直腸胃腹部外科，長春130012

大腸癌是常見的消化系統惡性腫瘤，位居全球腫瘤發病率和病死率的第2位，全球每年新發大腸癌病例約140萬例[1]，中國大腸癌的發病率和病死率增長迅速，且發病年齡明顯提前[2-3]。結腸癌的發生、發展是一個多靶點參與的復雜過程。p62蛋白為原癌基因c2myc的表達產物，其作為一種腫瘤基因編碼的蛋白，調控著細胞周期、增殖、凋亡及自噬過程[4-6]，在多種腫瘤的發生、發展過程中發揮重要作用[7-9]。然而，關于p62蛋白在大腸癌中作用及具體作用機制的生物學研究鮮有報道。本研究探討了60例大腸癌患者大腸癌組織和細胞中p62蛋白的表達情況及其在大腸癌細胞中的生物學特性，分析了p62蛋白在大腸癌發生、發展及轉移過程中的作用，旨在為大腸癌患者的臨床個體化治療提供理論依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2016年1月吉林省腫瘤醫院收治的大腸癌患者的臨床資料。納入標準：經病理學檢查確診為大腸癌；術前未接受過放療、化療等抗腫瘤治療；臨床資料完整。排除標準：合并其他部位惡性腫瘤；因其他原因在隨訪3個月內死亡。根據納入、排除標準，本研究共納入60例大腸癌患者，其中，男29例，女31例；年齡為42～60歲，中位年齡為52歲；臨床分期：I期11例，Ⅱ期14例，Ⅲ期20例，Ⅳ期15例。收集60例大腸癌患者的大腸癌組織及癌旁組織石蠟標本。

1.2 細胞與試劑

人大腸癌HT29和SW480細胞均購自美國模式菌種收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）；胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Hy-Clone公司；鼠抗人p62單克隆抗體和辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗鼠抗體均購自美國Santa Cruze公司；即用型免疫組化試劑盒、枸櫞酸鹽緩沖液、通用型二抗、二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液及一抗稀釋液均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）試劑和LipofectamineTM2000轉染試劑均購自美國Sigma公司；干擾小RNA（small interfering RNA，siRNA）由上海生工生物工程股份有限公司合成；電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）試劑購自美國Millipore公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡試劑盒購自美國BD公司。

1.3 細胞培養及轉染

將人大腸癌HT29和SW480細胞接種于含20%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的IMDM培養液中，置于37℃、5%CO2的培養箱中進行培養，每2～3天傳代一次。將處于對數生長期的HT29細胞按照每孔5×104個細胞接種于6孔板中，待細胞生長至70%左右時，選擇p62蛋白表達水平高的HT29細胞進行轉染，細胞轉染步驟嚴格參照LipofectamineTM2000轉染試劑盒操作說明書進行。將轉染72 h的HT29細胞分為3組：siRNA/p62組，轉染p62特異性siRNA；陰性對照組，不做任何處理；siRNA/SCR組，轉染陰性對照序列，即UU序列——5'-AUGUUUGCCAUGAGUAUUA-3'。轉染48 h后收集細胞進行后續實驗。

1.4 免疫組織化學染色法檢測不同組織中p62蛋白的表達情況及結果判定

將石蠟切片置于65℃烤箱內烘烤6～8 h，待脫蠟返水后，采用枸櫞酸鹽緩沖液（pH=7.4）高壓抗原修復2 min，待溫度降至室溫后，采用3%過氧化氫室溫封閉30 min，去除內源性過氧化物酶，4℃孵育一抗過夜，室溫復溫后加入通用型二抗，37℃孵育30 min，采用DAB進行顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片后于顯微鏡下觀察并拍照。采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）作為陰性對照代替一抗。p62蛋白主要定位于細胞核，以細胞核出現明顯的黃色或棕黃色顆粒判定為細胞陽性。根據陽性細胞所占比例和染色強度判定免疫組織化學染色結果[10]。

1.5 蛋白質印跡法（Westernblot）檢測不同細胞中p 62蛋白的表達情況

采用RIPA裂解液分別提取HT29和SW480細胞總蛋白，篩選出p62蛋白表達水平高的細胞系，提取3組HT29細胞的總蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacryl amide gel electrophoresis，SDS-PAGE）后將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上；在5%脫脂奶粉中封閉1 h；加入鼠抗人p62單克隆抗體（稀釋濃度為1∶1000），4℃孵育過夜，采用三乙醇胺緩沖鹽水溶液（tris buffered saline tween，TBST）清洗3次，每次10 min；加入HRP標記的羊抗鼠二抗（稀釋濃度為1∶500），室溫輕度振蕩1 h，應用ECL法于暗室顯色，曝光膠片并掃描。實驗重復3次。蛋白的相對表達量=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

1.6 MTT法檢測HT29細胞增殖率

分別取處于對數生長期的3組細胞，加入培養板中培養5 h，每組設3個復孔，24、48、72 h后每孔加入MTT，檢測490 nm波長處的光密度（optical density，OD）值，計算細胞增殖率。實驗重復3次。

1.7 劃痕實驗檢測HT29細胞的遷移能力

取對數生長期的3組細胞，采用無血清培養基培養12 h，在6孔板中分別輕劃2條垂直線，應用PBS清洗未貼壁的細胞。熒光顯微鏡下分別記錄不同時間點（12、24 h）的細胞遷移距離，每個實驗組設3個復孔，取其平均值。實驗重復3次。

1.8 隨訪

采用電話隨訪的方式對所有大腸癌患者進行隨訪，每月進行1次電話隨訪，隨訪時間為0～12個月，隨訪內容為患者的生存情況。

1.9 統計學分析

采用SPSS 13.0軟件對數據進行統計分析，計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗。計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，多個時間點重復測量數據采用重復測量方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 p62蛋白在不同組織中表達情況

免疫組織化學染色結果顯示，大腸癌組織細胞核中的棕黃色顆粒較多。大腸癌組織中p62蛋白的陽性表達率為66.7%（40/60），明顯高于癌旁組織的36.7%（22/60），差異有統計學意義（χ2=10.812，P＜0.01）。

2.2 不同臨床特征大腸癌患者大腸癌組織中p62蛋白的陽性表達情況

不同遠處轉移情況的大腸癌患者大腸癌組織中p62蛋白陽性表達率比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；不同年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度和臨床分期的大腸癌患者大腸癌組織中p62蛋白陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表1）

2.3 p62蛋白表達與大腸癌患者預后的關系

p62陽性表達的大腸癌患者的1年累積生存率為22.9%，p62陰性表達的大腸癌患者的1年累積生存率為72.0%。p62陽性表達和p62陰性表達的大腸癌患者的生存情況比較，差異有統計學意義（χ2=10.525，P＜0.01）。（圖1）

2.4 p62蛋白在大腸癌細胞中的表達情況

Western blot檢測結果顯示，p62蛋白在SW480和HT29細胞中均表達，HT29細胞中p62蛋白的表達水平為（0.73±0.06），明顯高于SW480細胞的（0.43±0.09），差異有統計學意義（t=5.684，P＜0.01）（圖2A）。HT29細胞中轉染p62蛋白72 h后，siRNA/p62組HT29細胞中p62蛋白的表達水平為（0.323±0.024），siRNA/SCR組HT29細胞中p62蛋白的表達水平為（1.510±0.216），陰性對照組HT29細胞中p62蛋白的表達水平為（1.730±0.114），3組比較，差異有統計學意義（F=85.561，P＜0.01）。siRNA/p62組HT29細胞中p62蛋白的表達水平明顯低于siRNA/SCR組和陰性對照組，差異均有統計學意義（t=15.281、17.035，P＜0.01）（圖2B）。

表1 不同臨床特征大腸癌患者大腸癌組織中 p62蛋白的陽性表達情況

圖1 p62蛋白陽性表達患者（n=40）與陰性表達（n=20）患者的生存曲線

圖2 Western blot法檢測p62蛋白在大腸癌HT29和SW480細胞中的表達情況

2.5 p62蛋白對HT29細胞增殖能力的影響

隨著時間的增加，3組HT29細胞的OD值不斷升高，差異有統計學意義（F時間=1.644，P時間＜0.01）；組間比較，差異有統計學意義（F組間=65.016，P組間＜0.01）。0 h時，3組HT29細胞的OD值比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；72 h時，3組HT29細胞的OD值比較，差異有統計學意義（F=28.27，P＜0.01）。24～72 h時，siRNA/p62組HT29細胞的OD值均明顯低于陰性對照組和siRNA/SCR組，差異均有統計學意義（t=7.047、7.047、5.774，P＜0.01）。（表2）

表2 轉染后不同時間點 3組HT29細胞的OD值（±s）

表2 轉染后不同時間點 3組HT29細胞的OD值（±s）

時間0 h 24 h 48 h 0.20±0.01 0.58±0.10 0.97±0.14 0.20±0.02 0.51±0.18 0.75±0.17 0.20±0.01 0.61±0.14 0.95±0.19 72 h陰性對照組1.25±0.05 siRNA/p62組0.90±0.07 siRNA/SCR組1.23±0.07

2.6 下調p62的表達對HT29細胞遷移能力的影響

隨著時間的增加，3組HT29細胞的遷移距離逐漸升高，差異有統計學意義（F時間=35810.143，P時間＜0.01）；組間比較，差異有統計學意義（F組間=318.778，P組間＜0.01）。12 h時，3組HT29細胞的遷移距離比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。24 h時，siRNA/p62組HT29細胞的遷移距離均短于陰性對照組和siRNA/SCR組，差異均有統計學意義（t=5.852、8.154，P＜0.01）；siRNA/SCR組和陰性對照組HT29細胞的遷移距離比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（表3）

表3 轉染后不同時間點 3組HT29細胞的遷移距離（mm，±s）

表3 轉染后不同時間點 3組HT29細胞的遷移距離（mm，±s）

時間陰性對照組siRNA/p62組siRNA/SCR組12 h 24 h 0.64±0.13 2.08±0.12 0.57±0.12 1.53±0.11 0.60±0.08 2.05±0.10

3 討論

p62蛋白是一種參與自噬、凋亡和腫瘤發生的關鍵蛋白，深入研究p62蛋白以及自噬與大腸癌的關系，對闡明大腸癌的發病機制以及尋找新的大腸癌的治療策略具有積極意義。研究發現，p62蛋白在啟動細胞存活信號以及細胞的增殖、分化和抗凋亡基因誘導方面發揮著重要的作用，并且在多種腫瘤中異常表達[11-13]。Inoue等[14]采用免疫組織化學染色法分析p62蛋白在109例非小細胞肺癌患者中的表達情況，結果發現，p62在37%的非小細胞肺癌中表達，并與非小細胞肺癌患者的不良預后有關，提示p62蛋白可能是影響非小細胞肺癌患者預后的重要因素。Schl?fli等[15]、吳文涌等[16]分別通過免疫組織化學法檢測人肝細胞癌中p62蛋白的表達情況，均發現其與肝細胞癌患者的不良預后密切相關。本研究結果發現，大腸癌組織中p62蛋白的陽性表達率明顯高于癌旁組織，且p62陽性表達患者與p62陰性表達大腸癌患者的生存情況比較，差異均有統計學意義（P＜0.01），提示p62蛋白在大腸癌中的表達水平較高，且p62蛋白的表達情況與患者的預后密切相關。本研究還探討了大腸癌組織中p62蛋白的表達情況與患者臨床特征的關系，結果發現，不同遠處轉移情況的大腸癌患者大腸癌組織中p62蛋白的表達情況比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；不同年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度和臨床分期的大腸癌患者大腸癌組織中p62蛋白的表達情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），提示大腸癌的發生可能與大腸癌患者的年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度和臨床分期無關，這為臨床大腸癌的治療提供了重要的實驗數據。相關研究結果顯示，p62蛋白在結腸癌化療耐藥機制中發揮著重要的作用，下調p62的表達可抑制結腸癌細胞的體外增殖和體內生長[17]，這與本研究的結果基本一致，本研究結果顯示，p62蛋白在結直腸癌細胞中的表達水平較高，且p62蛋白在HT29細胞中的表達水平高于SW480細胞，并證實了下調p62蛋白的表達對細胞的增殖具有抑制作用，表明p62蛋白可能參與調控大腸癌細胞的生長。為了進一步探討p62蛋白與腫瘤轉移的關系，本研究下調p62蛋白的表達后應用細胞劃痕實驗進行了驗證，結果顯示，下調p62蛋白的表達后，HT29細胞的遷移能力受損，表明p62蛋白不僅參與大腸癌細胞的生長，還參與大腸癌細胞的轉移。

綜上所述，p62蛋白參與大腸癌的生長和轉移，可能成為大腸癌進展和預后不良的潛在標志物之一。但本研究的不足之處在于納入的樣本量不足，因此，在后續的研究中將進一步補充臨床資料、擴大樣本量，深入研究p62蛋白在磷脂酰肌醇3-羥激酶/蛋白激酶B信號通路中的作用，以進一步闡明大腸癌發生、發展的潛在分子機制。