DNMT1通過miRNA-148b-3p調控腦膠質瘤 U87細胞替莫唑胺耐藥性的作用機制

彭耀中，杜鵬，張學勇

聊城市第二人民醫院1檢驗科，2腫瘤科，山東聊城252600

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器

人腦膠質瘤U87細胞系購自美國模式菌種收集中心（American TypeCultureCollection，ATCC）。TMZ、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、5-氮雜-2’-脫氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-CdR）、膜聯蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細胞凋亡試劑盒均購自美國Sigma公司，噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl tetrazolium，MTT）、LipofectamineTM2000試劑均購自美國Invitrogen公司，DMEM高糖培養基購自美國Gibco公司，Trizol試劑購自美國Life Technology公司，聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）引物、pcDNA-DNMT1過表達載體均購自生工生物工程（上海）股份有限公司，實時定量聚合酶鏈反應（realtime quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）儀購自美國BD公司，RNA提取試劑盒、TaqMan?miRNA試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix試劑盒、細胞凋亡試劑盒均購自美國Omega生物公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 U87/TMZ耐藥細胞培養將人腦膠質瘤U87細胞系培養在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養，24～48 h更換培養液，48 h傳代一次。收集對數生長期的人腦膠質瘤U87細胞系，1000 r/min離心5 min，棄去培養液，調整濃度為1×107/ml，加入含有10%胎牛血清的DMEM培養液，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h，待細胞貼壁后，加入5 μmol/L誘導劑量的TMZ，培養15～20天后，采用終濃度為10、20、40、80、160、320 μmol/L的TMZ溶液處理細胞，每個梯度濃度培養15～20天，最終獲得穩定生長的U87/TMZ耐藥細胞系，TMZ最佳濃度為20 μmol/L。

1.2.2 流式細胞儀檢測U87細胞和U87/TMZ耐藥細胞的凋亡情況采用20 μmol/L的TMZ分別作用于U87細胞和U87/TMZ耐藥細胞，胰蛋白酶消化后置入離心管中，2000 r/min離心5 min，除去上清液。采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗 3次，加入 400 μl的結合緩沖液（binding buffer）重懸細胞，加入5μl的 Annexin VFITC，4℃避光孵育20 min。上機檢測前5 min，加入5 μl的PI染液，采用流式細胞儀檢測U87細胞和U87/TMZ耐藥細胞的凋亡情況。實驗重復3次。

1.2.3 RT-PCR法檢 測MDR1、DNMT1、Bcl-2mRNA和miRNA-148b-3p的相對表達量取對數生長期的U87細胞和U87/TMZ耐藥細胞，Trizol法提取總RNA，測定mRNA濃度和純度，根據反轉錄試劑盒說明合成互補DNA（complementary DNA，cDNA），根據熒光定量RT-PCR試劑盒說明書進行擴增。反應條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，循環45次，以β-actin作為內參，采用2-△△Ct法計算MDR1、DNMT1、Bcl-2mRNA和miRNA-148b-3p的相對表達量。引物序列如下：MDR1正向引物為5'-CTTGGCATTGAGTGAAAGAAC-3'，反向引物為5'-ACAGGAGATAGGCTGGTTTGA-3'；Bcl-2正向引物為 5'-CATTGGGAGTTTCAAATCAGC-3'，反向引物為5'-CTTTGCATTCTTGGACGAGG-3'；DNMT1正向引物為5'-CTCCCTATTGTAAACTTGT-3'，反向引物為5'-ATAGGGTTCATTCCCATACG-3'；miRNA-148b-3p正向引物為5'-TGACTGGATTCGCTAGGTAGAAG-3'，反向引物為 5'-GGCAATTTTCAGAGCTATTAG-3'。

1.2.4 DNMT1抑制劑5-Aza-CdR處理U87細胞取對數生長期的U87細胞，加入2 μ mol/L的DNMT1抑制劑5-Aza-CdR處理24 h，收集細胞，RT-PCR法檢測miRNA-148b-3p的相對表達量。

1.2.5 U87/TMZ耐藥細胞轉染和分組方法轉染前1天，將U87/TMZ耐藥細胞接種至6孔板，5×105/孔，培養24 h，待融合度為50%～60%時，將空質粒、LipofectamineTM2000試劑和pcDNA-DNMT1過表達載體分別轉染至U87/TMZ耐藥細胞，并分別作為空白對照組、陰性對照組和pcDNA-DNMT1組，37℃、5%CO2細胞培養箱中培養24～48 h。

1.2.6 甲基化特異性聚合酶鏈反應（methylation specific polymerase chain reaction ，MSP）法檢測U87/TMZ耐藥細胞miRNA-148b-5p啟動子區甲基化水平取對數生長期的空白對照組、陰性對照組和pcDNA-DNMT1組U87/TMZ耐藥細胞，Trizol法提取總RNA，取800 μl去離子水加入至亞硫酸氫鈉混合物中，充分混勻、溶解。配置140 μl反應體系：85μl亞硫酸氫鈉混合物，35 μl DNA緩沖液，5 μl DNA 溶液，15 μl RNase-free水；反應條件：95℃ 5 min，60℃ 25 min，95℃ 5 min，60℃ 85 min，95℃5 min，60℃175 min。然后將反應液轉移至離心管中，加入560 μl新鮮配制的緩沖液，混勻；將反應產物分別裝入離心管中；3000 r/min離心5 min，除去收集柱中的液體；65℃烤箱中烘干；洗滌，收集離心管中的反應產物，將反應產物置于-80℃保存備用。將20 μl的反應體系（Taq Mix10 μl+cDNA模板2 μl+上下游引物1 μl+7 μl RNase-free水），反應條件：95℃預變性3 min，95℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸5 min，循環40次。以β-actin作為內參，采用2-△△Ct法計算3組U87/TMZ耐藥細胞miRNA-148b-3p啟動子區甲基化水平。

1.2.7 MTT法檢測U87/TMZ耐藥細胞的增殖能力取對數生長期的空白對照組、陰性對照組和pcDNA-DNMT1組U87/TMZ耐藥細胞，接種至96孔板中，1×104/孔，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中進行培養，每組設置8個復孔，培養24 h后，分別加入終濃度為 10、20、40、80、160 μmol/L（因預實驗顯示，160 μmol/L 的 TMZ處理細胞時，pcDNA-DNMT1組細胞的增殖抑制率已經達到平臺期，因此，未采用320 μmol/L的TMZ處理細胞）的TMZ溶液，培養48 h后，每孔加入20 μl的MTT，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中孵育4 h后，棄除上清液，每孔加入200 μl的DMSO溶液，置于振動器上振動5 min，置于顯微鏡下觀察無紫色結晶物。采用酶標儀于570 nm的波長處測量光密度（optical density，OD）值，計算細胞增殖抑制率，增殖抑制率（%）=1-OD值TMZ處理組/OD值空白組×100%。實驗重復3次。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件對所有數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

利用GRNN網絡進行的瓦斯涌出預測結果接近實際值，最大誤差僅有8%左右，可以用于瓦斯涌出量預測的實際生產中去[6]。在整個網絡的訓練中，GRNN網絡需要調整的參數只有一個光滑因子，因而有較快的收斂速度，可以更快地訓練出合適的網絡。在調用GRNN網絡時，需要輸入的設計參數只有一個擴展常數，使得網絡的形成受到的人為主觀影響較小，使得在預測中有更大的優勢。

2 結果

2.1 流式細胞儀檢測U87細胞和U87/TMZ耐藥細胞的凋亡情況

經20μmol/L的TMZ處理U87細胞和U87/TMZ耐藥細胞后，U87/TMZ耐藥細胞的凋亡率為（1.84±1.11）%，明顯低于 U87細胞的（15.47±2.09）%，差異有統計學意義（t=16.291，P＜0.01）。

2.2 MDR1、Bcl-2mRNA相對表達量的比較

U87/TMZ耐藥細胞中MDR1mRNA的相對表達量為（2.26±0.19），明顯高于U87細胞的（0.65±0.14），差異有統計學意義（t=19.295，P＜0.01）。U87/TMZ耐藥細胞中Bcl-2mRNA的相對表達量為（1.34±0.15），明顯高于U87細胞的（0.73±0.16），差異有統計學意義（t=7.867，P＜0.01）。

2.3 DNMT1mRNA和miRNA-148b-3p相對表達量的比較

U87細胞miRNA-148b-3p的相對表達量為（0.63±0.18），明顯低于 U87/TMZ耐藥細胞的（2.44±0.15），差異有統計學意義（t=21.849，P＜0.01）。U87細胞DNMT1mRNA的相對表達量為（1.15±0.17），明顯高于 U87/TMZ耐藥細胞的（0.84±0.13），差異有統計學意義（t=4.097，P＜0.01）。

2.4 DNMT1抑制劑5-Aza-CdR對U87細胞miR-NA-148b-3p相對表達量的影響

5-Aza-CdR處理后的U87細胞的miRNA-148b-3p相對表達量為（1.84±0.12），明顯高于未經5-Aza-CdR處理的U87細胞的（0.57±0.10），差異有統計學意義（t=22.996，P＜0.01）。

2.5 MSP法檢測U87/TMZ耐藥細胞miRNA-148b-5p啟動子區的甲基化水平

MSP法檢測結果顯示，pcDNA-DNMT1組U87/TMZ耐藥細胞中miRNA-148b-3p啟動子區甲基化水平為（0.64±0.17），高于空白對照組的（0.43±0.12）和陰性對照組的（0.45±0.11），差異均有統計學意義（t=2.854、2.654，P＜0.05）。

2.6 MTT法檢測U87/TMZ耐藥細胞的增殖能力

不同濃度TMZ溶液處理的pcDNA-DNMT1組U87/TMZ細胞的增殖抑制率，均明顯高于空白對照組和陰性對照組細胞，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1 不同濃度TMZ處理 3組 U87/TMZ耐藥細胞增殖抑制率的比較（%，±s）

表1 不同濃度TMZ處理 3組 U87/TMZ耐藥細胞增殖抑制率的比較（%，±s）

注：a與空白對照組比較，P＜0.01；b與陰性對照組比較，P＜0.01

TMZ濃度（μmol/L）10 20 40 80 160 1.29±1.20 3.50±1.36 18.24±4.65 43.77±8.10 54.89±8.79 2.33±1.15 4.38±1.40 17.26±4.81 42.18±7.25 53.46±8.12 14.48±3.47a b 20.04±4.18a b 45.85±7.31a b 78.81±6.05a b 79.26±6.80a b空白對照組陰性對照組pcDNA-DNMT1組

3 討論

對于惡化程度較高的膠質瘤患者，臨床多采用手術聯合放化療的綜合治療方案，其中烷化劑是最常用的化療藥物，TMZ屬于第二代咪唑并四嗪類烷化劑，且是臨床治療腦膠質瘤的一線化療藥物[6]。TMZ口服后可代謝為5-（3-甲基三氮烯-1-基）咪唑-4-甲酰胺，導致腫瘤細胞DNA中鳥嘌呤的O6位和N7位發生甲基化，從而發揮細胞毒性作用[7]。但在實際臨床中，超過30%的患者易對TMZ產生耐藥性，是腦膠質瘤患者化療失敗的主要原因。尋找預防高TMZ耐藥性的靶點，是進行個體化治療、提高患者預后的關鍵。

近年來，隨著基因組學和表觀遺傳學的不斷發展，基因甲基化與腫瘤發生發展的關系成為腫瘤領域研究的熱點。與遺傳學改變不同，基因甲基化過程中核苷酸序列未發生變化，而是通過DNA甲基化、染色體重構和組蛋白去乙酰化等調控相關基因的表達，參與機體的病理生理過程[8]。DNA甲基化在調控腫瘤發生發展過程中發揮重要作用，其可通過調控癌基因或抑癌基因的表達，參與腫瘤細胞生長、增殖、凋亡等生物學過程[9]。本研究首先通過梯度濃度化療藥物遞增誘導法建立了人神經膠質瘤細胞U87對TMZ耐藥的細胞系，即U87/TMZ耐藥細胞系，并通過檢測MDR1、Bcl-2mRNA的相對表達量驗證細胞對TMZ的耐藥性。MDR1基因編碼的P糖蛋白可在細胞內形成藥泵，從而將化療藥物泵出細胞外，從而使細胞產生耐藥性；同時P糖蛋白可以使細胞內環境堿化，以降低細胞對化療藥物的敏感性[10]。Bcl-2基因則屬于細胞凋亡相關基因，與抑制腫瘤細胞凋亡密切相關，Bcl-2表達上調，腫瘤細胞藥物抗性增強[11]。本研究中，U87/TMZ耐藥細胞中MDR1、Bcl-2mRNA的相對表達量均明顯高于U87細胞，表明U87/TMZ細胞具有較強的TMZ耐藥性。

腦膠質瘤對TMZ的耐藥機制較為復雜，除與DNA損傷修復途徑有關外，表觀遺傳調控也在其中發揮著關鍵作用[12]。近年來，miRNA與化療藥物的敏感性和耐藥性密切相關已被臨床廣泛認可。在前期研究中，研究小組通過靶基因預測數據庫Target Scan和microrna，發現miRNA-148b-3p與DNMT1存在互補序列，推測二者可能存在靶向關系[13]。miRNA-148b是近年來新發現的miRNA，屬于miRNA-148家族成員之一，在不同組織中的表達水平存在明顯差異[14]。前體miRNA-148b定位于染色體12q13.13，包括miRNA-148b-3p和miRNA-148p-5p[15]。既往研究表明，miRNA-148b-3p通過靶向WNT1/β-catenin信號通路，抑制肝癌細胞的增殖和侵襲[16]。在本研究中，U87細胞中miRNA-148b-3p的相對表達量明顯低于U87/TMZ耐藥細胞，但DNMT1miRNA的相對表達量卻明顯高于U87/TMZ耐藥細胞，將DNMT1抑制劑5-Aza-CdR作用于U87細胞，發現U87細胞miRNA-148b-3p的相對表達量明顯升高；同時，將pcDNA-DNMT1過表達載體轉染至U87/TMZ耐藥細胞珠，結果顯示，U87/TMZ耐藥細胞miRNA-148b-3p啟動子區域甲基化水平升高。表明DNMT1基因可能通過調節miRNA-148b-3p啟動子區域甲基化水平調節miRNA-148b-3p的相對表達量，從而進一步影響腫瘤細胞的增殖能力。DNMT1介導的DNA甲基化是表觀遺傳學基因調控的重要手段，在人神經膠質瘤細胞對TMZ耐藥過程中發揮關鍵作用[17]。

綜上所述，DNMT1與miRNA-148b-3p的表達密切相關，DNMT1可通過調節miRNA-148b-3p啟動子區甲基化水平負性調控miRNA-148b-3p的相對表達量，從而控制人腦膠質瘤細胞對TMZ的耐藥性。miRNA-148b-3p可能作為預測腦膠質瘤對TMZ治療敏感性的參考指標之一，為臨床個體化治療提供新的思路。