高效液相色譜法測定山楂藥材和小兒麥棗咀嚼片中枸櫞酸含量

吳 蓉，范勝蓮

（四川省攀枝花市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，四川 攀枝花 617000）

山楂、麥芽、神曲俗稱“焦三仙”，其中山楂為薔薇科植物山里紅Crataegus pinnatifidaBge.Var.major N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifidaBge.的干燥成熟果實。小兒麥棗咀嚼片由山藥、大棗、山楂和麥芽4味藥材經(jīng)現(xiàn)代工藝制成，收載于國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品標(biāo)準(zhǔn) WS-10409（ZD-0409）-2002-2012Z，臨床主要用于治療小兒脾胃虛弱、食欲不振、食積不化，有健脾和胃作用[1-3]。處方中的山楂和麥芽有健胃消食、行氣散瘀、去積滯、助消化功效，山楂和大棗具有補脾養(yǎng)胃、生津益肺、益氣補中、養(yǎng)血安神功效[4-6]。山楂中發(fā)揮消食作用的主要是成分是有機酸，其中以枸櫞酸的含量最高[7-9]。2015年版《中國藥典（一部）》山楂項下總有機酸的測定是以枸櫞酸的含量計算，但采用的滴定法在滴定過程中影響因素較多，且樣品顏色較深，不易準(zhǔn)確測定。本試驗中參考文獻[10-15]對其測定方法進行了改進，建立了高效液相色譜（HPLC）法測定山楂藥材和小兒麥棗咀嚼片中枸櫞酸的含量。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ultimate3000型高效液相色譜儀，包括全自動進樣器、恒溫柱溫箱、VWD檢測器、變色龍Chromeleon7工作站（美國賽默飛世爾公司）；AE240型電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

山楂藥材（批號分別為 181012，180502，180901，181203，190101）來源于攀枝花市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房，經(jīng)該院范勝蓮副主任中藥師鑒定為正品。小兒麥棗咀嚼片（葵花藥業(yè)集團＜佳木斯＞有限公司，批號分別為201801009，201811002，201812005，規(guī)格為每片 0.45 g）；枸櫞酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100396-201102，含量 99.9% ）；甲醇為色譜純，磷酸二氫銨、磷酸均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Welch-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相:甲醇（A）-0.5%磷酸二氫銨（B，磷酸調(diào)pH至2.8）溶液（5 ∶95，V／V）；流速:0.8 mL ／min；柱溫:25 ℃ ；檢測波長:210 nm；進樣量:10 μL。

2.2 溶液制備

對照品溶液:稱取在105℃干燥2 h后的枸櫞酸對照品11.98 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加水定容，作對照品貯備液；精密吸取2 mL置5 mL容量瓶中，加甲醇定容，作對照品溶液（每1mL含枸櫞酸0.4792mg）。

供試品溶液:取山楂藥材（批號181012），粉碎，過3號篩，稱取粉末0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加水50 mL，稱定質(zhì)量，靜置2 h，超聲（功率270 W，頻率40 kHz）處理30 min，再次稱定質(zhì)量，用水補足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作供試品溶液Ⅰ。取小兒麥棗咀嚼片（批號201801009）10片，研細，混勻，稱取粉末3.0 g，精密稱定，后同法操作，得供試品溶液Ⅱ。

陰性對照溶液:按小兒麥棗咀嚼片處方量的1／10制備缺山楂藥材的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗:精密吸取2.2項下4種溶液各10 μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，結(jié)果陰性對照溶液在與對照品溶液相同保留時間處無色譜峰（圖1），說明該方法的專屬性強，理論板數(shù)以枸櫞酸峰計不低于9000，分離度均大于1.5。

線性關(guān)系考察:取對照品貯備液作為5號對照品溶液；精密吸取2 mL，置10 mL容量瓶中，作為4號對照品溶液；然后精密吸取對照品溶液各1 mL，分別置25，50，100 mL容量瓶中，作為3號、2號、1號對照品溶液。分別吸取上述 1～5號對照品溶液各 10 μL，按 2.1項下色譜條件進樣測定，以進樣量（，ng）為橫坐標(biāo)、相應(yīng)峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程Y=0.0834+3.7633，r=0.9999（n=5）。結(jié)果表明，枸櫞酸進樣量在47.92～11980.00 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗:分別取上述1號、3號和5號對照品溶液，各連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD分別為2.06%，1.22%，0.42%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:取供試品溶液，室溫下分別放置0，1，2，4，8，12，24h時進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果山楂藥材和小兒麥棗咀嚼片中枸櫞酸峰面積的RSD分別為2.83%和2.19%（n=7），表明供試品溶液室溫下放置24h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗:分別取山楂藥材（批號181012）和小兒麥棗咀嚼片（批號201801009），依法同時制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，并計算樣品含量。結(jié)果的RSD分別為 0.78%和 1.24% （n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗:稱取已知含量的山楂藥材粉末共6份，每份0.25 g，同時稱取已知含量的小兒麥棗咀嚼片6份，每份1.5 g，精密稱定，分別加入適量枸櫞酸對照品溶液，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，計算樣品中枸櫞酸的加樣回收率。結(jié)果見表1。

圖1 高效液相色譜圖

表1 枸櫞酸加樣回收試驗（n=6）

2.4 樣品含量測定

取不同批次的2種樣品，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，結(jié)果見表2。并將結(jié)果與原標(biāo)準(zhǔn)中的滴定法進行比較，2種方法測得結(jié)果的RSD均小于3%，表明該方法可行。

表2 山楂藥材和小兒麥棗咀嚼片中枸櫞酸含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 供試品制備方法選擇

枸櫞酸是極性較大的有機酸，通常應(yīng)采用正相色譜柱進行分離，采用反相色譜柱分離時具有出峰速度快、不易受溶劑峰影響的優(yōu)點，且枸櫞酸易溶于水，因此在制備供試品時首先參考山楂藥材中枸櫞酸含量測定的處理方法。采用水作為提取溶劑進行浸泡，由于浸泡所需時間長，因此本試驗中在浸泡的基礎(chǔ)上又進行超聲處理，提高了提取效率。分別采用乙醇、50%甲醇和水3種溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水的提取效率最高，后采用正交試驗對提取溶劑的量、提取時間、超聲功率等因素進行綜合考察，最后確定樣品取樣量為3.0 g，浸泡2 h后再超聲30 min為最佳提取方法。

3.2 檢測波長及流動相選擇

在190～300 nm波長范圍內(nèi)對枸櫞酸對照品溶液進行掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在210 nm波長附近有最大吸收，因此選擇210 nm作為檢測波長。選擇流動相時先后采用甲醇 -0.1%磷酸溶液（5 ∶95，V／V）、乙腈 -0.2%磷酸二氫銨（磷酸調(diào)pH至3.0）溶液、甲醇-0.5%磷酸二氫銨（磷酸調(diào) pH 至 2.8）溶液（5 ∶95，V／V）等進行洗脫。結(jié)果以甲醇-0.1%磷酸溶液為流動相時，峰形不對稱，拖尾嚴(yán)重；乙腈-0.2%磷酸二氫銨（磷酸調(diào)pH至3.0）溶液作流動相時出峰較快，溶劑峰干擾較大。由于枸櫞酸在水溶液中很容易電離，產(chǎn)生多峰現(xiàn)象，為了使其盡可能地以分子形式存在，一般在流動相中加酸來抑制枸櫞酸的解離。以本試驗中選擇的甲醇-0.5%磷酸二氫銨（磷酸調(diào) pH 至 2.8）溶液（5 ∶95，V／V）為流動相時，枸櫞酸的色譜峰分離較好，峰形對稱。且以緩沖液作為流動相易控制其pH，從而保證樣品的重復(fù)性。

綜上所述，本研究中建立的HPLC法測定結(jié)果與原標(biāo)準(zhǔn)中的滴定法無顯著差異，可用于山楂藥材和小兒麥棗咀嚼片中枸櫞酸的含量測定。同時，HPLC法靈敏度高、分析速度快、抗干擾強，更適用于中成藥及基質(zhì)復(fù)雜樣品中枸櫞酸含量的測定。