高效液相色譜-二極管陣列檢測法同時測定二冬寧腦丸中橙皮苷、芍藥苷及阿魏酸含量

張桂平，楊榮波，王平晟

（1.河南省南陽市食品藥品檢驗所，河南 南陽 473000； 2.河北省南陽市中醫(yī)院，河南 南陽 473000）

二冬寧腦丸由天冬、麥冬、地龍、僵蠶、珍珠母、陳皮、赤芍、川芎等14味藥材組方，具有滋陰潛陽、化痰祛瘀功效，臨床主要用于治療陰虛陽亢痰瘀互結所致半身不遂、口眼歪斜、言語蹇澀或不語、感覺減退或消失等癥。方中陳皮主要成分為橙皮苷，具有理氣健脾、燥濕化痰等功效[1]；赤芍主要成分為芍藥苷，具有保肝、抗腫瘤、神經(jīng)保護、心臟保護、抗血栓、抗氧化、抗內毒素等多種藥理作用[2]；川芎主要成分為阿魏酸，有抗血小板凝集、抗血栓、抗菌、消炎、抗腫瘤、抗突變、增加免疫力等功效[3]。本試驗中采用高效液相色譜-二極管陣列檢測（HPLC-PDA）法同時測定二冬寧腦丸中橙皮苷、芍藥苷和阿魏酸含量。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A型高效液相色譜儀，包括SPD-M20A檢測器（日本Shimadzu公司）；XS205型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；SK5200H型超聲波清洗儀（上海科導超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

二冬寧腦丸（南陽市中醫(yī)院，批號分別為20161117，20170103，20170225，20171017，20171220，20180123，規(guī)格為每瓶 30 g）；橙皮苷對照品（批號為 110721-201617，含量96.1%），芍藥苷對照品（批號為110736-201741，含量95.7%），阿魏酸對照品（批號為110773-201614，含量99.0%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Welch Materials C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相:甲醇（A）-1% 乙酸溶液（B），梯度洗脫（0～15 min時 30%A，15～40 min時 30%A→35%A，40～42 min時 35%A→30%A，42～45 min時 30%A）；流速:1.0 mL ／min；檢測波長:284 nm（橙皮苷），230 nm（芍藥苷），321nm（阿魏酸）；柱溫:35℃；進樣量:10μL。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液:取阿魏酸對照品13.46 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加70%乙醇溶解并定容，搖勻，得對照品溶液Ⅰ；取橙皮苷對照品52.34 mg和芍藥苷對照品14.54 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加入對照品溶液Ⅰ10mL溶解，并加入70%乙醇定容，搖勻，得每 1 mL 含橙皮苷 0.5030 mg、芍藥苷 0.1391 mg、阿魏酸0.01333 mg的混合對照品貯備液，取4 mL，置10 mL容量瓶中，加70%乙醇定容，搖勻，即得混合對照品溶液。

供試品溶液:取樣品適量，研細，混勻，精密稱定1.5 g，置具塞錐形瓶中，加70%乙醇25 mL，稱定質量，浸泡過夜后，超聲（功率250W，頻率40kHz）處理30 min，放冷，再稱定質量，用70%乙醇補足減失的質量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照溶液:按二冬寧腦丸處方和工藝分別制備缺陳皮、赤芍、川芎的陰性樣品，分別制備陰性對照溶液。

2.3 方法學考察

系統(tǒng)適用性試驗:取上述對照品溶液、供試品溶液各適量，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。理論板數(shù)按橙皮苷、芍藥苷及阿魏酸峰計均應不低于3000，分離度均大于1.5，基線分離良好。

專屬性試驗:取對照品溶液、陰性對照溶液各適量，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。陰性對照溶液在與橙皮苷、芍藥苷、阿魏酸對照品溶液相同保留時間處無干擾峰，表明專屬性良好。

線性關系考察:分別精密量取混合對照品貯備液0.8，1.5，2.5，4.0，6.0，8.0 mL，置 10 mL 容量瓶中，加70%乙醇定容，搖勻，制成系列混合對照品溶液。量取10 μL，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（，μg／mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得橙皮苷、芍藥苷、阿魏酸回歸方程分別為Y=18181+70935（r=0.9997，n=6）、Y=12538X+ 8370.5（r=0.9995，n=6）、Y=67272-3143（r=0.9994，n=6）。結果表明，橙皮苷、芍藥苷、阿魏酸質量濃度在 40.24 ～402.40 μg／mL、11.128 ～ 111.280 μg ／mL、1.066 ～ 10.664 μg ／mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗:取混合對照品溶液適量，按擬訂色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果橙皮苷、芍藥苷、阿魏酸峰面積的RSD分別為 0.52%，0.74%，0.81%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液（批號為20170225）適量，分別于室溫下放置 0，2，4，8，12，24 h 時按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果橙皮苷、芍藥苷、阿魏酸峰面積的RSD分別為 0.68%，1.24%，1.37%（n=6），表明供試品溶液室溫放置24 h內基本穩(wěn)定。

重復性試驗:取樣品（批號為20170225）6份，精密稱定，依法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果橙皮苷、芍藥苷、阿魏酸平均含量分別為 3.214，0.819，0.080 mg／g，RSD分別為0.71%，0.95%，1.16%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗:取已知含量樣品（批號為20170225）適量，共6份，分別加入一定質量濃度的混合對照品溶液，依法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果見表1。

圖1 高效液相色譜圖

表1 加樣回收試驗結果（n=6）

2.4 樣品含量測定

取6批樣品各適量，依法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進樣測定，每批平行測定3次，取平均值，記錄峰面積并計算樣品含量。結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（mg／g，n=3）

3 討論

檢測波長選擇:取3種對照品進行全波長掃描，結果橙皮苷、芍藥苷和阿魏酸分別在284，230，321 nm波長處有最大吸收，故本試驗中在不同波長處測定3種成分，結果穩(wěn)定。

流動相選擇:采用不同比例的甲醇-0.05%磷酸溶液、甲醇-0.05 moL／L磷酸二氫鉀溶液、甲醇-1%乙酸溶液[4-5]、乙腈-1%乙酸溶液[6-8]作流動相進行比較，結果采用甲醇-1%乙酸溶液梯度洗脫時，各待測成分色譜峰峰形良好，分離度均大于1.5%，且陰性對照無干擾。

提取溶劑選擇:使用不同比例的甲醇和乙醇冷浸過夜后超聲30，60 min進行提取，結果發(fā)現(xiàn)，以70%乙醇為提取溶劑，冷浸過夜后超聲30 min，芍藥苷提取效率比以甲醇為提取溶劑時稍降低，但橙皮苷和阿魏酸提取效率最高，且干擾最少。

綜上所述，本研究中建立的方法操作簡便、準確，精密度、穩(wěn)定性、重復性均較好，可用于同時測定二冬寧腦丸中橙皮苷、芍藥苷和阿魏酸的含量。