復方桔梗止咳片的質量標準研究

楊超 鄧曉鴻 周娟

中圖分類號 R284.1文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）22-3074-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.22.10

摘 要 目 的：建立復方桔梗止咳片的質量標準。方法：采用薄層色譜法（TLC）對復方桔梗止咳片中桔梗、遠志、甘草進行定性鑒別;采用高效液相色譜法-蒸發光散射檢測法測定復方桔梗止咳片中桔梗皂苷D的含量。色譜柱為Agilent C18，流動相為乙腈-水（26 ∶ 74，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測器為蒸發光散射檢測器，漂移管溫度為105 ℃，載氣流速為3.0 L/min，柱溫為35 ℃。結果：桔梗、遠志、甘草的TLC圖譜中斑點清晰，分離度好，陰性對照未見相同斑點。桔梗皂苷D的進樣量線性范圍為0.421 9～5.062 8 μg（r=0.999 9）;定量限、檢測限分別為0.364、0.109 μg;精密度、穩定性、重復性、耐用性試驗的RSD均小于3.0%;加樣回收率為87.32%～91.96%（RSD=1.73%，n=6）。178批樣品中，桔梗皂苷D的含量為0.004～0.73 mg/片，有55批（30.9%）樣品中桔梗皂苷D含量低于本研究擬定的含量限度（0.10 mg/片）。結論：所建質量標準方法準確、可靠，可用于復方桔梗止咳片的質量控制。

關鍵詞 復方桔梗止咳片;桔梗;遠志;甘草;質量標準;薄層色譜法;高效液相色譜法-蒸發光散射檢測法;桔梗皂苷D;含量測定

Study on Quality Standard of Compound Platycodon grandiflorum Antitussive Tablets

YANG Chao，DENG Xiaohong，ZHOU Juan（Sichuan Institute for Food and Drug Control， Chengdu 611731， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To establish the quality standard of Compound Platycodon grandiflorum antitussive tablets. METHODS： TLC was used to identify the P. grandiflorum， Polygala tenuifolia and Glycyrrhiza uralensis qualitatively in Compound P. grandiflorum antitussive tablets. HPLC-ELSD method was used to measure the content of platycodin D in Compound P. grandiflorum antitussive tablets. The determination was performed on Agilent C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-water （26 ∶ 74， V/V） at the flow rate of 1.0 mL/min. ELSD was used with drift tube temperature of 105 ℃， gas flow rate of 3.0 L/min and column temperature at 35 ℃. RESULTS： TLC chromatograms of P. grandiflorum， P. tenuifolia and G. uralensis had clear spots with good separation and no same spot from negative samples. The linear range of platycodin D was 0.421 9- 5.062 8 μg （r=0.999 9）. The quantitative limit and detection limit were 0.364， 0.109 μg， respectively. RSDs of precision， stability， reproducibility and durability tests were all lower than 3.0%. The recovery rates were 87.32%-91.96% （RSD=1.73%，n=6）. The platycodin D contents of 178 samples ranged from 0.004 to 0.73 mg/tablet. The content of platycodin D in 55 batches （30.9%） of samples was lower than the content limit （0.10 mg/tablet） proposed in this study. CONCLUSIONS： Established method is accurate and reliable， and can be used for the quality control of Compound P. grandiflorum antitussive tablets.

KEYWORDS ? Compound Platycodon grandiflorum antitussive tablets; Platycodon grandiflorum; Polygala tenuifolia; Glycyrrhiza uralensis; Quality standard; TLC; HPLC-ELSD; Platycodin D; Content determination

復方桔梗止咳片是由桔梗、遠志（蜜炙）、款冬花（蜜炙）、甘草等4味藥材組成，具有鎮咳、祛痰的功效。方中桔梗為君藥，具宣肺、利咽、排膿之功，可用于治療咳嗽痰多、胸悶不暢、咽痛、音啞、肺癰吐膿等[1-4]。遠志、款冬花為臣藥，遠志具有鎮靜催眠、祛痰、抗衰老、抗癡呆、抗抑郁等作用[5-7];款冬花具有止咳化痰、潤肺下氣的功效，主要用于治療咳嗽、氣喘、止瀉等[8-10]。甘草為佐藥，具有調和諸藥、止咳潤肺、解毒、補虛、抗氧化、抗炎、調節免疫等功效[11-13]。復方桔梗片收載于《衛生部藥品標準（中藥成方制劑第4冊）》[14]，但其標準僅收載了性狀和檢查項（片重差異、崩解時限），無薄層鑒別（TLC）或含量測定項等。雖然有研究對復方桔梗止咳片進行了TLC鑒別，但其樣品提取方法較繁瑣，且使用了高毒性試劑三氯甲烷為提取溶劑[15-16];也有研究對復方桔梗止咳片中主要活性成分桔梗皂苷D的含量進行了測定，但其樣品前處理的方法較繁瑣[17-18]，且目前尚未見復方桔梗止咳片質量標準的相關研究。因此，為全面控制該制劑質量，本課題組對片劑中桔梗、遠志、甘草等3味組方藥材進行了TLC鑒別，并采用高效液相色譜（HPLC）-蒸發光散射檢測法（ELSD）測定了桔梗皂苷D的含量，現報道如下。

1 材料

1.1 儀器

1200型HPLC儀，包括G1322A型脫氣機、G1312A型二元泵、G1329A型自動進樣器、G1316A型柱溫箱（美國Agilent公司）;Alltech 2000ES型ELSD檢測器（美國Alltek公司）;CPA225D型十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）;HU20500D型超聲儀（天津市恒奧科技發展有限公司）。

1.2 藥材

桔梗對照藥材（批號：121028-201411）、遠志對照藥材（批號：120989-201107）、甘草對照藥材（批號：120904-201620）均購自中國食品藥品檢定研究院，經四川省食品藥品檢驗檢測院黎躍成主任藥師鑒定分別為桔梗科植物桔梗[Platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC.]的干燥根、遠志科植物遠志（Polygala tenuifolia Willd.）的干燥根、豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的干燥根和根莖。

1.3 藥品與試劑

桔梗皂苷D對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111851-201607，純度：94.0%）;178批復方桔梗止咳片來自24家生產企業（樣品來源信息見表1）;硅膠G薄層板（青島海洋化工廠分廠，批號：20171107）;乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 桔梗 取復方桔梗止咳片適量，除去包衣，研細，取約1 g，加乙酸乙酯4 mL，振搖后放置20 min，以8 000 r/min離心10 min，取上清液，作為供試品溶液。取桔梗對照藥材1 g，按上述供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。按復方桔梗止咳片處方和工藝制備缺桔梗的陰性樣品，取約1 g，按上述供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按2015年版《中國藥典》（四部）TLC法[19]，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-乙酸乙酯（4 ∶ 1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加熱5 min使斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照未見相同斑點，詳見圖1。

2.1.2 遠志 取復方桔梗止咳片適量，除去包衣，研細，取約5 g，加水30 mL，攪拌1 min后放置30 min，搖勻，以8 000 r/min離心10 min，取上清液，加乙酸乙酯30 mL，振搖，蒸干，殘渣加乙醇2 mL使溶解，搖勻，作為供試品溶液。取遠志對照藥材1 g，按上述供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。按復方桔梗止咳片處方和工藝制備缺遠志的陰性樣品，取約5 g，按上述供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按2015年版《中國藥典》（四部）TLC法[19]，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-丙酮（4 ∶ 1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照未見相同斑點，詳見圖2。

2.1.3 甘草 取復方桔梗止咳片適量，除去包衣，研細，取約5 g，加水30 mL，攪拌1 min后放置30 min，搖勻，以8 000 r/min離心10 min，取上清液，加乙酸乙酯30 mL，振搖，蒸干，殘渣加無水乙醇2 mL使溶解，搖勻，作為供試品溶液。取甘草對照藥材0.5 g，按上述供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。按復方桔梗止咳片處方和工藝制備缺甘草的陰性樣品，取約5 g，按上述供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。按2015年版《中國藥典》（四部）TLC法[19]，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-異丙醇（10 ∶ 1，V/V）為展開劑，預飽和1 h后展開，取出，晾干，噴以含1%三氯化鋁的10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加熱5 min 使斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照未見相同斑點，詳見圖3。

2.2 含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取桔梗皂苷D對照品適量，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得桔梗皂苷D質量濃度為0.421 9 mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取樣品20片，除去包衣，研細，取約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加70%甲醇50 mL，稱定質量，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過;取續濾液25 mL，回收至干，殘渣加水20 mL溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL;合并正丁醇提取液，加氨試液50 mL洗滌，棄去氨試液，回收至干，殘渣加甲醇分次溶解并轉移至2 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按復方桔梗止咳片處方和工藝制備缺桔梗的陰性樣品，取約2 g，按“2.2.2”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.2.4 色譜條件 色譜柱：Agilent SB C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈-水（26 ∶ 74，V/V）;流速：1.0 mL/min;檢測器：ELSD;漂移管溫度：105 ℃;載氣：空氣;載氣流速：3.0 L/min;樣品進樣量：2～20 μL;對照品進樣量：10 μL;柱溫：35 ℃[20]。在此色譜條件下，桔梗皂苷D與其他成分可達到基線分離，理論板數按桔梗皂苷D峰計均不低于3 000，分離度均大于1.5，陰性對照無干擾，詳見圖4。

2.2.5 線性關系考察 精密量取“2.2.1”項下對照品溶液1.0、3.0、5.0、8.0、10.0、12.0 μL，分別按“2.2.4”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積。以進樣量對數值（x）為橫坐標、峰面積對數值（y）為縱坐標進行線性回歸，得桔梗皂苷D的回歸方程為y=1.528 9x+2.424 8（r=0.999 9）。結果表明，桔梗皂苷D的進樣量線性范圍為0.421 9～5.062 8 μg。

2.2.6 定量限與檢測限考察 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液適量10 μL，用甲醇倍比稀釋，按“2.2.4”項下色譜條件進樣測定。以信噪比為10 ∶ 1、3 ∶ 1 分別計算定量限、檢測限。結果，桔梗皂苷D定量限為0.364 μg，檢測限為0.109 μg。

2.2.7 精密度試驗 取“2.2.1”項下對照品溶液適量10 μL，按“2.2.4”項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果，桔梗皂苷D峰面積的RSD為1.67%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：M-170610）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h 時，按“2.2.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，桔梗皂苷D峰面積的RSD為1.72%（n=7），表明供試品溶液于室溫下放置12 h 內基本穩定。

2.2.9 重復性試驗 取樣品（批號：M-170610）適量，研細，共6份，每份2 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品中桔梗皂苷D的含量。結果，桔梗皂苷D的平均含量為0.24 mg/片，RSD為1.68%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品（批號：M-170610）適量，共6 份，每份1 g，精密稱定，加入一定量的對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表2。

2.2.11 耐用性試驗 取已知含量的樣品（批號：M-170610）適量，按 “2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.4” 項下色譜條件分別以不同流速（0.9、1.0、1.1 mL/min）、不同色譜柱[Agilent SB C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）、 Kromasil 100-5-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、 Thermo GOLD C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）] 進樣測定并按標準曲線法計算樣品中桔梗皂苷D的含量，結果見表3。結果表明，本方法可滿足試驗要求，耐用性良好。

2.2.12 樣品含量測定 取178批樣品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液（含量較高的供試品需以甲醇適量稀釋），再按“2.2.4”項下色譜條件平行測定3次，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品中桔梗皂苷D的含量，結果見表4。由表4可知，178批樣品含量范圍為0.004～0.73 mg/片;按每片樣品中含桔梗（以桔梗皂苷D計）不得低于0.10 mg，有55批（30.9%）樣品不合格。

3 討論

本研究前期預試驗發現，方中款冬花藥材經過多次提取方法和展開條件的調整，其陰性對照仍有干擾，故在參考相關文獻[15-16]的基礎上，最終確定以桔梗、遠志、甘草為指標藥材進行TLC鑒別。

有研究發現，桔梗皂苷D為皂苷類成分，由于其無強發色基團，因此采用紫外檢測器時其檢測波長接近截止波長，導致末端吸收響應值低[21-22]。而ELSD為通用型檢測器，適于檢測無紫外吸收或弱紫外吸收的成分，故本研究采用ELSD檢測。此外，考慮到復方桔梗止咳片為復方制劑，成分復雜，本研究在參考相關文獻[17-18]的基礎上，比較了不同體積分數甲醇（100%、70%、50%）的提取效果。結果顯示，以70%甲醇、50%甲醇為提取溶劑時，桔梗皂苷D含量較高，綜合考慮提取液過濾的易操作性，故選擇70%甲醇為提取溶劑。同時，本研究還考察了不同超聲時間（20、30、40 min）及加熱回流時間（20、30、40 min）的提取效率。結果顯示，以超聲提取30、40 min和加熱回流30、40 min時桔梗皂苷D含量較高，綜合考慮操作的簡便性及試驗時間的長短，最終選擇超聲提取30 min。

本課題組對色譜條件的柱溫（30、35、40 ℃）也進行了考察，結果顯示，當柱溫為30 ℃時，色譜峰的出峰時間較長、峰較寬，不利于色譜峰分離;由于供試品中桔梗皂苷D峰的前方有一個雜質峰，當柱溫升高至40 ℃時，色譜行為發生變化，使得該雜質峰更靠近桔梗皂苷D峰，使分離度達不到測定的要求，因此本研究選擇柱溫為35 ℃。

為評價樣品的質量，本研究根據其處方和工藝（取桔梗藥材146 g、遠志藥材38 g、款冬花藥材22.5 g、甘草藥材14 g，粉碎，以細粉入藥，制成1 000片復方桔梗止咳片[14]）;同時，參考2015年版《中國藥典》（一部）桔梗藥材項下含量測定項規定的“本品按干燥品計算，含桔梗皂苷D（C57H92O28）不得少于 0.10%[20]”，結合生產過程中的損失，本研究將樣品中桔梗皂苷D的含量限度擬定為每片樣品中含桔梗（以桔梗皂苷D計）不得低于0.10 mg。含量測定結果顯示，178批樣品中桔梗皂苷D 含量范圍為0.004～0.73 mg/片，按上述含量限度要求，有55批（30.9%）樣品中桔梗皂苷D含量不達標，其中有5家生產企業的所有樣品均低于含量限度值，分別為生產企業C、D、L、T、X，可能與其采用的桔梗藥材質量和生產工藝有關 。有2家生產企業（生產企業H、V）均存在同一企業不同批號樣品中桔梗皂苷D含量差異較大的情況，可能與其采用的桔梗藥材來源及生產工藝參數控制不穩定有關。

綜上所述，本研究所建質量標準方法準確、可靠，可用于復方桔梗止咳片的質量控制。

參考文獻

[ 1 ] 李盈，王舉濤，桂雙英，等.桔梗的化學成分及藥理作用研究進展[J].食品與藥品，2016，18（1）：72-75.

[ 2 ] 金欣，陳勤.桔梗的藥理作用研究新進展[J].現代中藥研究與實踐，2015，29（2）：79-82.

[ 3 ] 梁仲遠.桔梗水提液的鎮咳、祛痰作用研究[J].中國藥房，2011，22（35）：3291-3292.

[ 4 ] 孫荏苒，張滿云，陳勤.桔梗皂苷膠囊抗炎止咳平喘作用研究[J].中藥藥理與臨床，2010，26（4）：27-29.

[ 5 ] 張陶珍，榮巍巍，李清，等.遠志的研究進展[J].中草藥，2016，47（13）：2381-2389.

[ 6 ] 劉麗.中藥遠志的研究進展概論[J].中醫臨床研究，2017，9（34）：146-148.

[ 7 ] 劉大偉，康利平，馬百平.遠志化學及藥理作用研究進展[J].國際藥學研究雜志，2012，39（1）：32-36、44.

[ 8 ] 侯阿嬌，郭新月，滿文靜，等.款冬花的化學成分及藥理作用研究進展[J].中醫藥信息，2019，36（1）：107-112.

[ 9 ] 張燕.款冬花毒性、活性部位及藥理作用的研究進展[J].中國實用醫藥，2015，10（35）：287-288.

[10] 陳雪園，張如松，楊蘇蓓.款冬花化學成分及藥理毒理研究進展[J].亞太傳統醫藥，2012，8（1）：173-174.

[11] 姜雪，孫森鳳，王悅，等.甘草藥理作用研究進展[J].化工時刊，2017，31（7）：25-28.

[12] 李冀，李想，曹明明，等.甘草藥理作用及藥對配伍比例研究進展[J].上海中醫藥雜志，2019，53（7）：83-87.

[13] 張利.甘草的藥理作用及現代研究進展[J].中醫臨床研究，2014，6（10）：147-148.

[14] 衛生部藥典委員會.中華人民共和國衛生部藥品標準：中藥成方制劑第4冊[S].北京：人民衛生出版社，1991：121.

[15] 簡淑娟，翁雪萍.復方桔梗止咳片的薄層色譜鑒別[J].廣東藥學，2001，11（6）：29-30.

[16] 王勛久，王一平，楊增福.復方桔梗止咳片的顯微與薄層色譜鑒別[J].基層中藥雜志，2000，14（5）：20.

[17] 陳國寧，邰順章，黃柳燕.高效液相色譜-蒸發光散射檢測器法測定復方桔梗止咳片中桔梗皂苷D含量[J].中國藥業，2014，23（18）：51-52.

[18] 張秀麗，鄭琰，崔巖. HPLC-ELSD法測定復方桔梗止咳片中桔梗皂苷D的含量[J].中國醫藥指南，2015，13（15）：55-56.

[19] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[S].2015 年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：57-59.

[20] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015 年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：277.

[21] 李文庭，祝明，馬臨科，等.桔梗的HPLC-ELSD指紋圖譜研究[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（22）：50-53.

[22] 筆雪艷，劉曉鳳，張清波，等.桔梗藥材及飲片的質量標準研究[J].中醫藥信息，2011，28（6）：69-71.

（收稿日期：2019-04-29 修回日期：2019-08-30）

（編輯：陳 宏）