3例16p11.2微缺失綜合征胎兒的產前診斷及其產前超聲分析*

（湖北省婦幼保健院 優生遺傳科，湖北 武漢 430070）

16p11.2 微缺失綜合征是因為16號染色體p11.2存在復發性雜合缺失區域而引起的一類綜合征。16p11.2微缺失綜合征于2008年由KUMAR等在自閉癥譜系障礙病因的研究中首次提出[1]。國外流行病學研究其人群發病率為0.3‰[2]。患者的主要臨床癥狀包括：發育遲緩、智力障礙和/或自閉癥譜系障礙。患者的智商通常在輕度智力障礙到正常之間，但智力正常的也往往有其他發育問題，如語言發育遲緩或者自閉癥譜系障礙[3]。大部分患者還有發生超重和肥胖的風險[4]。20%患者有癲癇發作，2歲之前常出現巨頭畸形。16p11.2微缺失綜合征的各種出生缺陷均略微增加，但以椎體畸形最為常見。

16p11.2 微缺失綜合征可以由拷貝數變異的方法如染色體微陣列（chromosomal microarray analysis,CMA）或目標缺失分析方法如熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization,FISH）技術檢出。單核苷酸多態性微陣列（single nucleotide polymorphism array,SNP array）技術能夠檢出 ＞50 kb 的 CNVs，能準確地檢測出16p11.2微缺失綜合征。目前，16p11.2微缺失綜合征的產前診斷報道較少，本研究通過對3例16p11.2微缺失綜合征胎兒的產前遺傳學分析，結合其超聲異常特點，探討其基因型與表型的對應關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

病例1，漢族，G4P1，孕23周因胎兒超聲提示胸腰段脊柱側彎，L12～S1呈半椎體畸形，單臍動脈（右側缺如），右心室強光斑，經孕婦知情同意后于孕24周行羊水穿刺術。病例2，漢族，G3P1，孕24周因胎兒超聲提示胎兒脊柱側彎（L11～12，S1椎體向右側側彎），椎體排列不整齊（半椎體），羊水指數位于正常值上限，經孕婦知情同意后于孕25周行羊水穿刺術。病例3，漢族，G1P0，孕13周因胎兒超聲提示NT 4.8 mm，胎兒鼻骨顯示不清，經孕婦知情同意后于孕18周行羊水刺術。病例4，漢族，G3P1，胎兒系統超聲檢測未見異常，孕19周因高齡（41歲）經孕婦知情同意后行羊水穿刺術，為正常對照組。4個病例所抽取的羊水均行常規G顯帶染色體核型分析和SNP array檢測。

1.2 方法

1.2.1 常規羊水染色體核型分析孕婦在超聲連續引導定位下行羊膜腔穿刺術，抽取胎兒羊水28 ml，無菌操作下分別進行體外培養。培養好的羊水細胞經收獲、固定、核型制備和G顯帶。染色體異常的描述依據《人類細胞遺傳學國際命名體制2016版》。

1.2.2 全基因組DNA 提取 使用 QIAamp ? DNA Mini Kit（250）試劑盒抽提取羊水的全基因組DNA，提取的DNA置于-20℃冰箱冷凍儲存備用。芯片實驗前使用Nanodrop one分光光度計定量，標準化并稀釋樣本濃度至 50 ng/μl。

1.2.3 SNParray 檢測缺失基因 采用 Cyto Scan 750K芯片（包括55萬個拷貝數探針和20萬個SNP探針）進行檢測。芯片檢測所需DNA總量為250 ng。采用Affymetrix公司配套檢測試劑盒及優化的標準操作流程，進行酶切、連接、PCR、PCR產物純化、片段化、標記、雜交、洗染、掃描等幾個步驟。整個過程嚴格按照質控標準進行。用 Affymetrix Chromosome Analysis Suite Software進行分析。利用國際基因組變異數據庫DGV（http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home）剔除常見的多態性CNV，其余CNV與CNVs數據庫DECIPHER（https://decipher.sanger.ac.uk/patient/）、OMIM（https://omim.org）、ISCA（https://www.iscaconsortium.org/）比對分析，在 PubMed數 據 庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）上檢索相同或相似區段的CNV研究的文獻。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitativerealtime polymerase chain reaction,qRT-PCR） 根據 3個16p11.2微缺失病例DNA缺失區域，選擇共有缺失序列區域為擴增子，設計正反向引物，選擇ALB基因為內參，作為靶標拷貝數相對定量的依據；所有引物設計及序列特異性比對均使用Primer 5.0 and National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool software（blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。該驗證靶標及內參引物序列見表1，擴增體系使用 ABI SYBR Green PCR Master Mix，樣本均使用TE稀釋成5 ng/μl，加樣時取2 μl作模板；使用ABI 7500 熒光定量 PCR 儀，選擇 SYBR Green Reagent模式。擴增條件：95℃預變性5 min及熱啟動酶激活，95℃變性 15 s、60℃退火 40 s，45個循環。每個樣品檢測3個復孔，實驗進行3次重復。

表1 16p11.2（hg19）微缺失區域實時熒光定量PCR檢測所用引物序列

1.3 統計學方法

數據分析采用 Microsoft Office Excel 2010 統計軟件，計算相對值、均值及標準差。

2 結果

2.1 G顯帶核型分析結果

病例1和病例2胎兒羊水染色體核型為46，XX，病例3和病例4胎兒羊水染色體核型為46，XY。見圖1。

2.2 SNP array分析結果

病例 1 的 SNP array結果為 arr [hg19]16p11.2（29，428，531 ～ 30，350，748）X1，即 16p11.2 存在 922 kb的缺失。病例2的SNP array結果為arr[hg19]16p11.2（29，591，326～30，176，508）X1，即16p11.2存在585 kb 的缺失。病例 3 的 SNP array結果為 arr[hg19]16p11.2（29，428，531～30，176，508）X1，即16p 11.2存在748 kb的缺失（見圖2）。3個病例均未檢測到其他基因組位點的致病性或可疑致病性變異。病例4的SNP array結果未檢測到致病性或可疑致病性變異。

2.3 qRT-PCR結果

病例1～3在16p11.2（hg19）相對拷貝數幾乎均是病例4的50%，病例1～3胎兒羊水細胞存在16p11.2雜合缺失，而病例4不存在缺失。見表2。

2.4 妊娠結局

病例1、病例2和病例3分別于孕27周、孕28周和孕21周行引產術，但均未同意進行引產后的病理解剖。病例4于孕38+2周剖宮產健康男嬰1例。

圖1 胎兒羊水染色體核型

圖2 3例SNP array結果

表2 qRT-PCR數據統計

3 討論

16p11.2 微缺失綜合征根據缺失區域主要分為2類：①典型16p11.2缺失綜合征（OMIM：611913），為 16 號染色體 29.5～ 30.1 Mb 區域上 500 ～ 600 kb的缺失，是最常見的類型。該區域覆蓋有：PRRT2、KCTD13、TBX6、HIRIP3、SEZ6L2等29個基因。②非典型16p11.2缺失（OMIM：613444），為16p11.2末端28.73～28.95 Mb區域上200～220 kb的缺失，這類型缺失較少見。此區域包含SH2B1、CD19、SPNS1等9個基因[5]。兩種類型16p11.2微缺失綜合征因為缺失區域的基因不同，臨床癥狀也不同，本文主要討論典型16p11.2缺失綜合征。

16p11.2 微缺失綜合征的發生是因為在16p11.2區域兩端有低拷貝重復序列（low copy repeats,LCRs），它位于微缺失區域兩端，長約147 kb片段（147A和147B），它們之間有99.5%序列同源[6]。2段低拷貝重復序列造成基因組的不穩定性，使得在細胞減數分裂過程中易引起同源染色體上非等位基因的重組（nonallelic homologous recombination,NAHR），從而導致微缺失和微重復的產生。

16p11.2 微缺失內部包含25個注釋基因或轉錄子，同時在低拷貝重復序列中還包含4個額外的基因，其中包含幾個重要的功能基因如PRRT2、KCTD13、TBX6、HIRIP3、SEZ6L2等。目前，這些基因的缺失是如何導致患者表型的機制尚不明確，但是最近的一些研究逐步揭示該關鍵基因的作用以及它們引起表型的功能通路。PRRT2基因可能是引起16p11.2微缺失綜合征患者癲癇或嬰兒性驚厥的關鍵基因。PRRT2基因雜合功能丟失型致病變異可以導致發作性運動誘導性運動障礙及引起良性家族性嬰兒性癲癇與舞蹈手足徐動綜合征[7]。KCTD13基因是斑馬魚和小鼠神經元增殖的關鍵驅動因子，也是引起16p11.2微缺失綜合征巨頭畸形的主要驅動因子，缺失區域內的MAPK3和MVP基因可能作為修飾基因增強KCTD13基因的表達[8]。HIRIP3基因產物和HIRA結合形成HIRA-HIRIP3復合物，在染色質和組蛋白代謝中發揮重要的功能，16p11.2缺失后可能因為HIRIP3基因單倍劑量不足，從而導致主動脈瓣畸形的發生[9]。SEZL6L2基因的單倍劑量不足可能是導致16p11.2微缺失綜合征語言遲緩、認知障礙和自閉癥的重要因素。與SEZL6L2基因同源的SEZ6基因缺陷性小鼠顯示出空間記憶受損、運動障礙和焦慮程度降低。SEZ6L2基因不僅在人類大腦中有高表達，且與導致癲癇和言語障礙的SRPX2基因高度同源[10]。TXB6基因是引起16p11.2微缺失綜合征患者椎體畸形的關鍵基因[11]。TBX6基因編碼一個轉錄因子，它在小鼠的體節發生中發揮了關鍵作用[12]。POURQUIE等[13]研究發現TXB6基因敲除小鼠出現與人類相同的脊椎肋骨發育不全和先天性脊柱側彎等表型。SPARROW等[14]證明TXB6基因突變后影響TBX6蛋白的轉錄活性從而導致脊椎肋骨發育不全，并發現攜帶1個TBX6無功能等位基因的小鼠胚胎，46%有輕度的頸椎缺陷，30%存在骶骨缺損。FEI等[15]研究發現，在中國漢族人群中TBX6基因上的2個單核苷酸多態性位點：rs2289292和rs3809624，這2個位點的多態性在先天性脊柱側彎的發病機制中起重要的作用。WU等[16]進一步研究發現在中國漢族人群中TBX6基因以一種特殊的作用形式：無功能等位基因（包括16p11.2微缺失綜合征中TBX6基因的缺失）合并另一個常見的亞效等位基因單體型T-C-A（3個常見的單核苷酸多態性位點：rs2289292、rs3809624、rs3809627）而導致半椎體和脊柱側彎。

16p11.2 微缺失綜合征患者有明顯表型異質性和不同的外顯率。ROSENFELD等報道16p11.2微缺失綜合征（TBX6）的外顯率46.8%（31.5%～64.2%），這可能與TBX6基因的特殊致病方式（1個無功能等位基因合并另一個常見的亞效等位基因單體型T-C-A）相關[16-17]。在千人數據庫中，TBX6基因T-C-A單體型在中國漢族人群中占44%，因此，理論上在中國漢族人群中16p11.2微缺失綜合征（TBX6）的外顯率應為44%。而且TBX6基因雜合性缺失的表型在不同種族中也不盡相同，在中國漢族人群主要導致半椎體畸形、脊柱側彎[16，18]。

目前，16p11.2微缺失綜合征的產前診斷報道較少，僅有少數文獻報道其超聲異常征象有心臟畸形、單側多囊腎、鼻骨缺失、單臍動脈、宮內發育遲緩等[19-20]。16p11.2微缺失綜合征的其他表型如發育遲緩、智力障礙和/或自閉癥譜系障礙、肥胖等表型具有年齡依賴性，無法在宮內診斷，而半椎體畸形、脊柱側彎在中國漢族人群中外顯率較高，可以依靠產前超聲進行診斷。筆者所報告2例的病例均表現為半椎體畸形、脊柱側彎。病例1超聲提示胎兒胸腰段脊柱側彎，L12～S1呈半椎體畸形，單臍動脈（右側缺如），右心室強光斑。病例2超聲提示胎兒脊柱側彎（L11～12，S1椎體向右側側彎），椎體排列不整齊（半椎體），羊水指數位于正常值上限。而病例3超聲僅提示胎兒頸部半透明膜4.8 mm，鼻骨顯示不清。一方面可能是由于16p11.2微缺失綜合征存在外顯率與表現度的差異；另一方面也可能是由于患者后續未行胎兒系統彩超進一步監測病情的進展。在本研究中，筆者采用全基因組SNP array技術對3個病例進行分析，不僅在分子水平準確地檢出胎兒16p11.2微缺失綜合征，而且排除其他基因組位點的異常。

綜上所述，16p11.2 微缺失綜合征在產前可出現各個系統超聲異常，但椎體畸形最為常見。中國漢族人群產前超聲中如果出現胎兒半椎體畸形、脊柱側彎，應考慮16p11.2微缺失綜合征的可能。SNP array分析可以有效地診斷16p11.2微缺失綜合征，明確其斷裂點以及所涉及的基因，有助于分析其基因型與表型的對應關系。