鴨疫里氏桿菌的分離及PCR鑒定

范榮香

鴨疫里氏桿菌病又稱鴨傳染性漿膜炎，是危害養鴨業的主要細菌性傳染病。該病主要侵害1-8周齡健康鴨，尤其引起2-3周齡雛鴨大批發病，病死率可高達80%或以上。發病鴨以倦怠、縮頸、不食或少食、眼鼻出現大量分泌物、綠色下痢、共濟失調和抽搐為主要臨床特征。隨著集約化養鴨業的發展，該病的流行日趨嚴重，而細菌分離鑒定、PCR檢測，是實驗室最常用的檢測方法，靈敏度較高、特異性較強，在微生物檢測方面應用十分廣泛。本文根據實驗室采集的病料進行細菌分離、形態染色觀察、生化鑒定、PCR反應，鑒定該菌株為鴨疫里氏桿菌。

一、材料和方法

1、材料

（1）病料來源

某養殖場飼養的300只肉鴨突然發病，發病日齡為16日齡，臨床表現：主要以偏頸、眼鼻有分泌物、綠色下痢、站立不穩、運動失調為基本特征。并出現死亡，每天死亡10-20只左右，3天死亡57只，死亡率為19%。發病后用青霉素、土霉素、磺胺二甲嘧啶等抗菌藥物治療均未見效。

（2）病料處理

剖檢?。ㄋ溃?只，呈現典型纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎。無菌操作采病死鴨腦、心血、肝臟做病料觸片及細菌分離培養。

（3）藥品與試劑

革蘭氏染色液、PBS、普通培養基、鮮血瓊脂平板、巧克力平板、伊紅美藍平板、麥康凱平板、SS培養基、TSA培養基、生化發酵管、PCR反應試劑（rTaq、dNTP、Mgcl2、10×PCRbuffer）和DNAMarker等購自寶生物工程（大連）有限公司。

（4）主要試驗儀器

恒溫箱、冰箱、干燥箱、厭氧培養箱、顯微鏡、高速離心機、BIORAD凝膠成像系統。

2、方法

（1）細菌分離培養

無菌操作取?。ㄋ溃喣X、心血、肝臟病料劃線接種于普通瓊脂平板、鮮血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板各2份，分別放在厭氧和有氧條件下，37℃培養24-48h，觀察菌落特征，挑選單個菌落革蘭氏染色。

（2）細菌的純化

在巧克力瓊脂平板上鉤取厭養條件下生長的鴨疫里氏桿菌可疑菌落，分別接種于伊紅美藍平板、麥康凱平板，SS培養基，TSA培養基，置厭氧條件下，38℃培養24-48h，觀察細菌的生長情況、菌落特征等。并將純化后的菌種放入-20℃的冰箱中凍干保存。

（3）生化試驗鑒定

挑選TSA培養基上單個、典型菌落，接種于各生化發酵管中，37℃厭養培養24-48h后，觀察發酵情況。

（4）PCR鑒定

①模板DNA的提取

無菌挑取2-3個待鑒定的菌株長成的菌落，放于EP管中，加入500ul雙蒸水，吹打懸浮;4000rpm離心5min，棄上清，加500ul的TE（PH=8.0）懸浮;加入5ul溶菌酶，37℃，20min;加入RNase1.5ul、10%SDS62.5ul，充分混勻，37℃水浴30min;加入20mg/ml蛋白酶K2.5ul，充分混勻，37℃水浴90min;用苯酚，苯酚：氯仿：異戊醇，氯仿各抽提一次，經乙醇沉淀后溶于20ulTE中保存備用。

②引物的設計

運用primer5.0軟件，根據已發表的RA的camp基因序列，設計一對引物，引物序列分別為：

上游引物（RAF）：5' GAA ?CTT ?TGG ?TCT ?TGG ?TAT ?CC 3'

下游引物（RAR）：5' CAG ?ATG ?CAG ?CTC ?TTT ?CTC ?TA 3'

③PCR反應循環參數

將混合物吹打均勻后，至PCR儀中擴增。反應條件如下：95℃預變性4分鐘，94℃45秒，55℃45秒，72℃45秒，30個循環，72℃延伸10分鐘，PCR反應結束后，取5ulPCR產物在1%瓊脂糖凝膠中90V電泳35min，在BIORAD凝膠成像系統下觀察擴增片段大小。

二、結果與分析

1、細菌分離培養

該菌株在普通瓊脂平板上不生長，在厭氧條件下的鮮血瓊脂平板和巧克力瓊脂平板上生長良好。菌株接種鮮血瓊脂平板37℃燭缸培養24h后，鮮血瓊脂平板上不溶血、長凸起、閃光呈奶油狀小菌落，約1.5mm;在巧克力瓊脂平板上長隆起、表面光滑、透明的圓形菌落，約2mm。

2、細菌的純化

在巧克力瓊脂平板上鉤取的鴨疫里氏桿菌可疑菌落，分別接種的伊紅美藍平板、麥康凱平板、SS培養基均不生長，在TSA平板上37℃燭缸內培養24h，形成圓形、隆起、露珠樣、直徑為0.5-2mm的菌落。

3、生化特性

將從病料中分離出的細菌進行生化鑒定，結果（見表1）。

4、PCR擴增產物

對樣品進行檢測，擴增出1條670bp的特異性目的片段（見圖1）。

三、結論

鴨疫里氏桿菌病的診斷可根據鴨群發病情況，臨床癥狀和病理變化做出初步診斷，確診需結合實驗室診斷分離出鴨疫里氏桿菌。本病的發生與病原污染飼養環境的累積有關，主要經呼吸道或通過皮膚傷口感染而發病。此外，飼養管理不當、密度過大、地面潮濕、空氣混濁、過冷和過熱，飼料缺乏維生素、微量元素或蛋白質等均是發病不可忽視的誘因。還應在冬春季節做好防寒保暖工作，盡量減少不良應激因素的刺激，養殖場最好實行“全進全出”的飼養管理制度。建議加強鴨群的飼養管理，對發病鴨通過藥敏試驗選出敏感抗生素進行治療，在治療的同時要結合電解多維飲水，提高鴨群機體抵抗力。

（作者單位：271600 山東省肥城市畜牧獸醫服務中心）