超高效色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定奶粉中三聚氰胺的不確定度評(píng)定

林顯活

摘 要：對(duì)《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》測定奶粉中三聚氰胺的不確定度進(jìn)行了評(píng)定，分析和量化影響測定結(jié)果的不確定度分量，將不確定度分量合成，得到奶粉中三聚氰胺含量的擴(kuò)展不確定度為

1.75 μg·kg-1。

關(guān)鍵詞：奶粉;三聚氰胺;超高效色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;不確定度

Abstract：The uncertainty of measurement in determination of melamine in milk powder was evaluated according to the method for determination of melamine in raw milk and dairy products by UPLC-MS/MS. The components of uncertainty were analyzed， quantified and composed. The expanded uncertainty of melamine in milk powder is 1.75 μg·kg-1.

Key words：Milk powder; Melamine; UPLC-MS/MS; Uncertainty

中圖分類號(hào)：O657.7

測量不確定度是表征合理地賦予被測量值的分散性，與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)，是衡量測試結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性的重要參數(shù)。在ISO/IEC17025：2005-5-15《檢測和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》中對(duì)測量不確定度的評(píng)定作出了明確要求。隨著測量不確定度被廣泛的認(rèn)識(shí)和接受，本文通過GB/T 22388-2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》對(duì)實(shí)驗(yàn)室測定奶粉中三聚氰胺含量的不確定度進(jìn)行評(píng)定，對(duì)影響測定結(jié)果的不確定度分量進(jìn)行分析和量化，求得測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度，并對(duì)測量結(jié)果進(jìn)行了表述。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

（1）儀器。Quattro Premier XE超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC-MS/MS），美國Waters公司生產(chǎn);HU-20500D超聲波清洗器，天津恒澳科技發(fā)展有限公司生產(chǎn);電子天平;離心機(jī)。

（2）試劑。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：三聚氰胺，購自德國Dr. Ehrenstorfer公司;乙腈、甲醇，均為色譜純，購自美國Fisher公司;三氯乙酸，分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 奶粉中三聚氰胺的測定方法

按照GB/T 22388-2008 《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》測定奶粉中的三聚氰胺，稱取1 g樣品，用1%三氯乙酸提取，乙酸鋅沉淀蛋白，離心過濾后，以固相萃取小柱凈化，氮吹儀吹干，最后定容至1 mL，過膜，LC-MS/MS檢測，外標(biāo)法定量測定奶粉中的三聚氰胺。

1.2.2 測試條件

（1）色譜條件。色譜柱：Acquity UPLC BEH C18，1.7 μm，100×2.1 mm;柱溫：35 ℃;進(jìn)樣體積：5 μL;流動(dòng)相：A為0.1%的甲酸-水溶液，B為乙腈;流速：0.2 mL·min-1，梯度洗脫：0～2.5 min，95%A;2.51～3.0 min，10%A;3.1～4.5 min，95%A。

（2）質(zhì)譜條件。電離方式：電噴霧正離子（ESI+）模式;掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）;毛細(xì)管電壓：3.5 kV;離子源溫度：120 ℃;脫溶劑溫度：350 ℃;脫溶劑氣流：N2，流速600 L·h-1;錐孔氣流：N2，流速50 L·h-1;碰撞氣：氬氣，流速0.12 mL·min-1。

1.3 不確定度分量的主要來源及數(shù)學(xué)模型

本方法的不確定主要來源有：①樣品稱量不確定度。②樣液定容體積不確定度。③標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及稀釋時(shí)引入的不確定度。④線性回歸方程引入的不確定度。⑤回收率不確定度。⑥LC-MS/MS定量校準(zhǔn)引入的不確定度。

2 不確定度量化

2.1 樣品稱量不確定度

稱取樣品1.207 6 g，天平的精度為0.000 1 g，允許誤差為±1 mg，取矩形分布（又叫均勻分布），則不確定度

2.2 樣液定容體積不確定度

樣品經(jīng)萃取、凈化后用1.0 mL單標(biāo)刻度的移液管定容至1.0 mL。

校準(zhǔn)：根據(jù)校準(zhǔn)規(guī)程標(biāo)準(zhǔn)JJG 196-2006 《常用玻璃量器檢定規(guī)程》給出的1 mL單標(biāo)刻度移液管（A級(jí)）的容量允差為±0.007 mL，取矩形分布，則定容體積引入的不確定度：

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及稀釋引入的不確定度

稱取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品用50%甲醇定容于50 mL容量瓶（A級(jí)）中，配制成100 μg·mL-1的儲(chǔ)備液。用

1 mL可調(diào)移液器吸取0.50 mL，置于10 mL容量瓶

（A級(jí)）中，用50%甲醇定容，配制成5μg·mL-1的中間標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。再用1 mL可調(diào)移液器吸取系列體積的5 μg·mL-1的中間標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于50 mL容量瓶中，定容稀釋成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。其濃度計(jì)算公式為：

式（4）中：ci-工作標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，ng·mL-1;mi-稱取的標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量，g;pi-標(biāo)準(zhǔn)品的純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）;V50-標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液定容時(shí)的容量瓶體積，mL;V10-中間標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液定容時(shí)的容量瓶體積，mL;Vvipe-可調(diào)移液器的體積，mL;V50-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液定容時(shí)的容量瓶體積，mL。

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品純度

pi=99%，擴(kuò)展不確定度為0.5%，擴(kuò)展因子為2，則相對(duì)不確定度計(jì)算如下：

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品稱量

稱取三聚氰胺10.25 mg，使用的天平精密度為0.01 mg，允差為±0.1 mg，取矩形分布，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與稀釋過程的體積引入的不確定度

（1）50 mL容量瓶體積：根據(jù)校準(zhǔn)規(guī)程JJG 196-2006《 常用玻璃量器檢定規(guī)程》，20 ℃時(shí)50 mL容量瓶（A級(jí)）的容量允差為±0.05 mL，取三角分布，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

重復(fù)性：對(duì)50 mL容量瓶充滿20次并稱量的實(shí)驗(yàn)，得標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.090，直接作為標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

溫度：甲醇的熱膨脹系數(shù)為1.43×10-5 ℃-1，水的熱膨脹系數(shù)為2.07×10-4 ℃-1，容量瓶在20 ℃校準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)是在25 ℃條件下進(jìn)行，容量瓶和溶液溫度與校準(zhǔn)時(shí)不同所引起的體積變化為

（2）10 mL容量瓶體積：根據(jù)校準(zhǔn)規(guī)程JJG 196-2006 《常用玻璃量器檢定規(guī)程》，20 ℃時(shí)10 mL容量瓶（A級(jí)）的容量允差為±0.020 mL，取三角分布，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

重復(fù)性：對(duì)10 mL容量瓶充滿10次并稱量的實(shí)驗(yàn)，得標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.022，直接作為標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

（3）1 mL可調(diào)移液器的體積Vvipe：根據(jù)校準(zhǔn)規(guī)程JJG 646-2006《移液器檢定規(guī)程》，1 mL可調(diào)移液器在0.50 mL檢定點(diǎn)的容量允差為±1.0%，按矩形分布，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

重復(fù)性：校準(zhǔn)規(guī)程JJG 646-2006給出的重復(fù)性RSD≤0.5%，得標(biāo)準(zhǔn)偏差S≤0.50×0.5%=0.002 5 mL，

即為其標(biāo)準(zhǔn)不確定度。合成：

1 mL可調(diào)移液器移液點(diǎn)體積Vi：體積校準(zhǔn)：各移液點(diǎn)體積的容量允差、分布類型及不確定度計(jì)算見表1;重復(fù)性：1 mL可調(diào)移液器各相應(yīng)移液點(diǎn)體積重復(fù)性引起的不確定度計(jì)算見表2;合成：1 mL可調(diào)移液器移液點(diǎn)體積合成不確定度見表3。

2.4 線性回歸方程引入的不確定度

配制一系列三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為10、20、50、100 ng·mL-1和200 ng·mL-1，定量離子的峰面積分別為：2 246、4 909、1 0121、20 217、40 988。線性回歸方程為：Y=202.9X+231.66，r=0.999 6。對(duì)樣品平行測定6次，由線性回歸方程計(jì)算出樣品的平均濃度為c0=12.24 ng·mL-1。標(biāo)準(zhǔn)溶液系列濃度的平均值cs=76ng/mL，則由最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

當(dāng)t檢驗(yàn)值大于等于臨界值t95（8）=2.31時(shí)，R與1.0有顯著性差異，回收率校正因子必須在公式中采用，以修正結(jié)果;當(dāng)t檢驗(yàn)值小于臨界值t95（8）時(shí)，R與1.0無顯著性差異，不需要采用校正因子來修正結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)中t檢驗(yàn)值大于t95（8）=2.3，需要采用校正因子fr來修正結(jié)果。

2.6 LC-MS/MS儀器定量校準(zhǔn)

儀器商提供的LC-MS/MS定量的允差為5%，取矩形分布，則相對(duì)不確定度為：

3 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成與擴(kuò)展

當(dāng)上機(jī)試液中三聚氰胺含量為12.24 ng·mL-1，稱樣量為1.207 6 g，定容體積為1.0 mL時(shí)，樣品中三聚氰胺的質(zhì)量濃度w為10.14 μg·kg-1。

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u（X）=w×ur（X）=10.14×

0.086 5=0.877 μg·kg-1。

取包含因子k=2，置信概率p=95%，則擴(kuò)展不確定度為u=2×0.877=1.75 μg·kg-1。引入校正因子fr=88.4%，則三聚氰胺的含量為10.14÷88.4%=11.47 μg·kg-1。

4 測定結(jié)果報(bào)告

該奶粉樣品中三聚氰胺含量為（11.47±1.75）μg·kg-1。