類志賀毒素Ⅱ型變異體（SLT-IIe）基因表達及間接ELISA方法的建立

王警 張雪寒 郭蕓蕓 張碧成 吳慶俠 何孔旺

摘要：試驗針對產類志賀毒素大腸桿菌SLT-IIe初步建立一種豬水腫病大腸桿菌的血清學檢測方法。通過原核表達構建出重組崖pET28a-sumo-SLT-IIe/BL21在IPTG誘導下獲得表達，表達產物以包涵體形式產生，使用十二烷基肌氨酸鈉（SKL）變性的生化提純步驟獲取有生物學活性的重組蛋白。將提取的SLT-He蛋白作為抗原包被ELISA板，初步建立了特異性強的豬水腫病診斷方法，方陣滴定確定抗原最佳包被濃度為2μg/孔，最佳血清稀釋濃度是1：25，HRP-羊抗豬二抗的工作濃度1：15000，5%脫脂奶封閉1h，顯色15min。該方法的建立對豬水腫病流行病學調查以及預防和控制該病的發生有重要意義。

關鍵詞：豬水腫病;產類志賀毒素大腸桿菌;SLT-IIe;ELISA

中圖分類號：S852.61 文獻標識碼：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.08.003

0 引言

豬水腫病是仔豬的一種急性致死性傳染病，主要由O138、O139等血清型產類志賀毒素大腸桿菌引起的腸毒血癥[1]，主要發生于斷奶仔豬。發病率通常為10%～35%，病死率高達90%[2]。類志賀毒素Ⅱ型變異體（SLT-IIe）又稱豬水腫毒素，是豬水腫病的重要致病因子[3]，其分子結構由1個A亞單位和5個B亞單位組成[4]。

產SLT-IIe大腸桿菌的傳統診斷方法是用Vero細胞和小鼠神經毒性試驗，并以抗SLT-IIe血清或單克隆抗體做中和試驗鑒定，但診斷程序比較繁瑣。以SLT-IIe特異性抗體為診斷試劑的ELISA具有高度的特異性[5]。試驗通過原核表達SLT-IIe重組蛋白，并以此作為包被抗原建立同時檢測SLT-IIe抗體的間接ELISA方法，研制檢測SLT的試劑盒。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒及血清

原核表達載體pET28a-sumo（帶有11.2kD的sumo標簽）、IPTG、豬SLTEC標準陽性血清和陰性血清，均為江蘇省農業科學院獸醫研究所保存;Sac-1與Bsa-1購自BioLabs;辣根過氧物酶（HRP）標記的羊抗豬IgG購自BETHYL。

1.2 原核表達載體構建及重組蛋白表達和提取

參考Gen Bank上公布的SLT-IIe基因序列（登錄號：M21534）設計特異性引物，大小為219bp。將SLT-IIe基因雙酶切后克隆入pET28a-sumo載體，構建重組質粒。

陽性重組菌OD600值達到0.4～0.6時，加入IPTG進行誘導表達12h后進行SDS-PAGE鑒定表達情況。將菌液離心后的沉淀裂解后用20% SKL貯存液提取SLT-IIe重組蛋白。

1.3 間接ELISA檢測方法

用pH為9.6的碳酸鹽緩沖液將純化的重組蛋白以4μg/孔、2μg/孔倍比稀釋至0.03125μg/孔后，每孔100μL包被酶標板，血清從1：25、1：50倍比稀釋至1：12800進行矩陣滴定;二抗1：15000稀釋，用TMB顯色，2mol/L的H₂SO₄終止反應測定OD_450nm值。選擇陽性OD大于1，陰性OD介于0.1～0.2，P/N值最大時的抗原濃度和血清稀釋度。在此基礎上分別對酶標二抗的工作濃度、封閉液種類、封閉時間等逐優化。計算10份未感染SLT-IIe的陰性豬血清與標準陽性血清OD_450nm的比值S/P以及其平均值X及標準方差SD，陰陽性臨界值=X+3SD作為EMSA判定標準。

1.4 特異性試驗

按已建立的間接ELISA方法操作，分別檢測已知PEDV、TGEV、FMDV、O157：H7和大腸桿菌F4和F5陽性血清，每份血清做2個重復。用酶標儀測定各孔OD_450nm值，確定該間接ELISA方法的特異性。

1.5 臨床樣品檢測

檢測實驗室保存的不同日齡未免疫豬水腫病疫苗的豬血清共409份，其中新生未吃初乳的仔豬血清10份、2周齡30份、3周齡67份、4周齡35份、5周齡50份、6周齡及以上周齡母豬血清共206份。

2 結果

2.1 原核表達載體的構建與重組蛋白的表達

重組崖pET28a-sumo-SLT-IIe/BL21經IPTG誘導，目的蛋白獲得高效表達，分子量大小約為25kD，條帶單一，見圖1。

2.2 間接ELISA方法的建立

經方陣滴定法確定并優化的ELISA反應條件：包被抗原濃度為2ug/孔，血清稀釋度為1：25;酶標二抗的稀釋度為1：15000，封閉時間為1h，底物最佳反應時間為15min。經計算，10份血清的S/P平均值X=0.140，SD=0.0330，因此ELISA陰陽性臨界值為X+3SD=0.239。

2.3 特異性試驗

檢測已知的PEDV、TGEV、FMDV、O157、F4和F5的陽性血清S/P值均小于0.239，判定為陰性，表明該方法具有良好的特異性，見表1。

2.4 臨床豬血清檢測

檢測本實驗室保存的不同日齡豬血清409份結果顯示，新生仔豬陽性率為0，2周齡陽性率達83.33%，此后的陽性率呈逐步上升趨勢，5周齡的增幅相對較高。新生未吃初乳仔豬幾乎不發病，但2周齡的豬陽性率顯著增高，呈現出大面積流行和爆發，分析其原因可能是該豬場存在環境的污染和帶菌豬的廣泛傳播;5周齡陽性率偏高，據了解該豬場生豬在5周齡斷奶，可能導致了陽性率的升高，這與豬水腫病的流行病學規律一致。

3 討論與結論

近年，SLT-IIe大腸桿菌LAMP檢測方法的建立及被初步應用[6]，Craig S[7]開發并鑒定了4種針對SLT-IIe的單克隆抗體，使用這些單抗對SLT-IIe的檢測限為11.8pg/mL，這些免疫學方法的建立比較耗時且成本較高。研究中建立的間接ELISA方法成本低，可以檢測血清中的IgG抗體。

研究通過SLT-He基因的克隆和原核表達，用SLT-IIe表達蛋白作為包被抗原，采用方陣滴定方法確定抗原的最佳包被濃度和血清最佳稀釋倍數，優化了各項反應條件。利用建立的SLT-IIeELISA診斷方法對409份本實驗室保存的不同日齡未免疫豬水腫病疫苗的豬血清進行檢測，未吃初乳的小豬陽性率為。，2周齡的仔豬呈現爆發性流行，分析其原因這可能是由臨床環境引起，豬水腫病的傳染源來自病豬和帶菌仔豬，其糞便會排出大量的致病性大腸桿菌。作為一種條件性致病菌，在一定條件下，攜帶有SLT-IIe毒素蛋白的大腸桿菌在豬舍間廣泛傳播，導致豬場環境被污染，進而造成豬水腫病的爆發和地方流行。研究中建立的SLT-IIeELISA診斷方法可以有效的檢測豬場中SLT-IIe的攜帶和感染狀況，陽性率高低能反應豬群的實際感染情況，對豬水腫病流行病學調查以及控制該病的發生十分重要。

參考文獻

[1]孫海清.Stx2e毒素酶活性位點突變體毒素生物學特性及免疫保護性的研究[D].揚州：揚州大學，2013.

[2]Moxtey R A.Veterinary Clinics of North America Food AnimalPractice[J].Edema disease，2000，16（1）：175-185.

[3]楊明柳.致豬水腫病大腸桿菌二重PCR檢測方法及三價滅活菌苗研究[D].武漢：華中農業大學，2007.

[4]林藝遠.致豬水腫病大腸桿菌ELISA抗體檢測方法及基因工程亞單位疫苗的初步研究[D].武漢：華中農業大學，2006.

[5]張強，張雪寒，何孔旺，等.ETEC F4-F5融合基因表達及間接ELISA方法建立[J]中國獸醫學報，2016，36（8）：1312-1317.

[6]丁建民，江馗語，朱江巍，等.致豬水腫病主要毒力因子-產志賀毒素Ⅱ型變異體大腸桿菌LAMP檢測方法的建立及初步應用[J].農家致富顧問，2017（16）：35-38.

[7]Craig S，Stephanie P，Hernlem B J，et al.New Stx2eMonoclonal Antibodies for Immunological Detection andDistinction of Stx2 Subtypes[J].PLOS ONE，2015，10（7）：e0132419.

基金項目：江蘇省重點研發計劃（BE2017341-1）

作者簡介：王警（1993-），女，碩士研究生，主要從事食源性病原菌分離、鑒定和遺傳進化分析工作。

通信作者：吳慶俠，副教授，從事家畜生殖內分泌與生殖免疫研究。

何孔旺，研究員，從事人獸共患病防控技術和致病機制研究。