LPS注射對家蠶幼蟲MyD88基因的影響

李佳璇 王濤 李樹強 司徒金容 劉吉升

摘 ?要：為探究LPS（脂多糖）等外源物質對家蠶MyD88基因表達的影響，本實驗將無菌水、LPS和大腸桿菌注射到5齡家蠶幼蟲體腔內，在0、3、6和24 h進行解剖取樣，通過凝膠電冰分析不同時間MyD88基因在各組織中的表達水平。電泳條帶顯示，在脂肪體組織中，注射LPS和大腸桿菌均可引起MyD88基因上調表達，6 h效果最佳;在中腸組織中，注射LPS 3 h 時MyD88基因表達量最高，注射大腸桿菌在6 h時條帶亮度最亮。結果表明MyD88基因可能響應LPS和大腸桿菌引起的家蠶免疫表達反應。

關鍵詞：家蠶;MyD88;注射;LPS;大腸桿菌

MyD88是機體內重要的轉導蛋白，在信號轉導途徑中起到關鍵作用[1]。Lord等發現髓樣分化基因家族的新成員MyD88，認為MyD88能夠調節髓樣細胞分化[2]。在哺乳類動物中，MyD88基因主要表達于T細胞、B細胞中[3]。

在家蠶中，MyD88基因在中腸（midgut，MG）、脂肪體（fat body，FB）、表皮（epidermis，EP）等主要免疫器官中的表達量相對其他較高[4]。MyD88是家蠶先天免疫通路Toll通路上重要的接頭分子，研究表明，MyD88與活化的Toll受體的TLR結構域連接，再與Tube、Pelle蛋白結合成三聚體形式，從而實現信號細胞內傳導[5]。

革蘭氏陰性桿菌細胞壁的主要成分為LPS（lipopolysaccharide），機體感染后會出現毒性反應，LPS作為大腸桿菌（Escherichia coli）細胞壁的主要成分，參與大腸桿菌引起的免疫反應[6]。Liu等研究發現LPS能夠激起昆蟲先天免疫反應，同時BmToll9-2基因在家蠶幼蟲的不同組織參與LPS等外源病原體的識別過程[7]。然而，作為Toll通路的下游因子MyD88能否對LPS做出免疫反應，目前在家蠶中還未明確。

本文利用注射法，對家蠶5齡幼蟲進行不同處理，通過凝膠電泳條帶，分析MyD88基因在不同處理下的表達水平。本研究進一步揭示家蠶Toll通路中MyD88基因層面上免疫系統對特定外源物質的響應。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

本研究使用廣東省農科院蠶業與農產品加工研究所提供的P50品系家蠶。孵化后的幼蟲在25℃、60 %的相對濕度、光周期12L：12D條件下，以新鮮桑葉飼養。

1.2 家蠶幼蟲的注射實驗及解剖取樣

對家蠶幼蟲分別注射10 μLLPS溶液（2.5 mg/μL）和10 μL大腸桿菌稀釋液（2.5 × 106 cells/μL），同時以注射等量無菌水作為陰性對照。在注射后的0、3、6 和24 h進行解剖取樣，平行取樣3組，所有樣品迅速置于無RNA酶的離心管中，保存于-80℃冰箱備用。

1.3 RNA的提取和cDNA的合成

采用RNAiso Plus（TaKaRa）試劑盒，按其說明書提取總RNA，并用NanoDrop 2000檢測，置于-80℃保存。參照PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）說明書，采用10 μL的反應體系;25℃ 10 min，42℃ 60 min的反應條件進行反轉錄。

1.4 PCR擴增和凝膠電泳

使用Primer Premier 6.0軟件進行設計PCR引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。內參基因選擇BmActin基因，檢測基因為MyD88基因。采用2 × Taq PCR MasterMix（艾德萊）試劑盒和20 μL的反應體系進行PCR擴增。擴增條件：94℃ 2 min;94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 30 s，共33次循環;72℃延伸10 min。PCR產物進行1.5 %瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀下觀察實驗結果。

2 結果與分析

2.1 不同處理后脂肪體組織中BmMyD88基因表達水平分析

通過凝膠電泳圖分析，注射無菌水時，MyD88基因在0、3 h條帶較暗，6、24 h的條帶亮度相近（圖1：A）;注射LPS時，MyD88基因在3 h的條帶亮度明顯增強，6 h達到最亮，24 h減弱到最暗（圖1：B）;注射大腸桿菌，MyD88基因在3 h的條帶亮度略微增強，6 h條帶最亮（圖1：C）。

2.2 不同處理后中腸組織中BmMyD88基因表達水平分析

通過凝膠電泳圖分析，注射無菌水時，MyD88基因在0、3、6 和24 h的條帶亮度相對一致（圖2：A）;注射LPS時，MyD88基因在3 h的條帶亮度明顯增強，6、24 h逐漸變暗（圖2：B）;注射大腸桿菌，MyD88基因在6 h的條帶最亮，24 h的條帶亮度減弱到與3 h相近（圖2：C）。

3 討論

本實驗對家蠶5齡幼蟲進行LPS注射，結果顯示，注射LPS后MyD88基因均能在脂肪體和中腸中于不同時間段被誘導表達，中腸中效果更加明顯。中腸作為細菌經口侵入家蠶體內的第一道防線，感染后能抗菌基因的表達，引起腸道免疫反應[8]，同時家蠶幼蟲在5齡階段接近變態發育，此時中腸的蛋白種類與數量提高，中腸活動十分旺盛[9]。

同時本實驗進一步用大腸桿菌注射檢驗，對比發現，分析發現大腸桿菌較LPS誘導效果更佳、時長更久。推測由于大腸桿菌含有更多的LPS，另一方面同時大腸桿菌中含有與家蠶Toll通路中相互作用的活性物質，從而促進對家蠶MyD88基因的誘導表達[10]。

哺乳動物中TLR4被LPS激活后會引起早期的MyD88依賴型信號通路[11]，昆蟲的Toll9具有和哺乳動物TLR4在進化上相對保守，結構相似[12-13]。張若男等研究發現，BmToll9蛋白在家蠶響應LPS的免疫途徑與哺乳動物中響應LPS的蛋白受體TLR4極其類似[14]，推測家蠶Toll通路中MyD88基因也能被LPS激活，參與LPS和大腸桿菌引起的免疫應答反應。

綜上所述，注射LPS和大腸桿菌激起家蠶幼蟲MyD88基因上調表達，揭示含LPS的革蘭氏陰性菌能夠激起家蠶的免疫反應，MyD88基因可能參與昆蟲Toll通路對LPS等外源病原體的識別過程。為明確MyD88基因在家蠶先天免疫Toll通路系統中的作用，還需通過基因敲除等手段進一步研究。

參考文獻

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項目名稱：“攀登計劃”廣東大學生科技創新培育專項資助。