酸奶中葡糖桿菌的快速分子檢測(cè)

摘 要：葡糖桿菌是污染酸奶的常見菌種，隨著人們健康意識(shí)的提高，酸奶的安全問題越來越受到人們的關(guān)注和重視。本文通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)驗(yàn)證引物的可行性及靈敏度后，使用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，以快速檢測(cè)酸奶中的葡糖桿菌。

關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞葡糖桿菌;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);凝膠成像分析系統(tǒng)

中圖分類號(hào)：S-3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A?DOI：10.19754/j.nyyjs.20191030009

1 引言

酸奶對(duì)人體的營養(yǎng)價(jià)值受到大眾越來越多的關(guān)注[1-2]，然而微生物代謝、繁衍極易引起酸奶的腐敗變質(zhì)[3-4]，酸奶遭到微生物毒害而引發(fā)食物中毒的事件在全球?qū)乙姴货r。葡糖桿菌屬于醋酸菌科[5]，并且是較早發(fā)現(xiàn)且研究的菌屬，其可導(dǎo)致酸奶腐敗變質(zhì)。分子生物學(xué)手段中的PCR技術(shù)目前受到越來越多的重視[6-8]，使得酸奶中微生物的檢查變得更加精準(zhǔn)[9-10]，本文以葡糖桿菌為檢測(cè)目標(biāo)，通過PCR后的電泳成像來判斷酸奶中受葡糖桿菌污染的程度。

2 材料與方法

2.1 材料

葡糖桿菌屬來源于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)信息學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室;PCR引物、DNA Maker、Goldeen view、瓊脂糖、電泳緩沖液、提取緩沖液購自生工公司。

2.2 方法

2.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI網(wǎng)站查找的葡糖桿菌16S rDNA特異基因序列，通過生物信息學(xué)網(wǎng)站Primer3 Input設(shè)計(jì)引物，上游引物：CTCAGTGTCGAAGCTAACGC;下游引物：GAGGTCCGAAGAAAGGTCCA，擴(kuò)增長度1478bp。

2.2.2 擴(kuò)增方法

3 結(jié)果與分析

3.1 基因組純度檢驗(yàn)

通過基因試劑盒進(jìn)行葡糖桿菌菌株的基因提取，酸奶中葡糖桿菌基因利用酶解法提取，提取的DNA進(jìn)行OD260/OD280檢測(cè)，以鑒定DNA純度，如表3。經(jīng)測(cè)定提取的DNA基因組的值均在1.8左右，說明DNA純度良好。

3.2 引物特異性檢驗(yàn)

以自制滅菌純酸奶、純種葡糖桿菌和接種葡糖桿菌的酸奶為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組，對(duì)照組未添加任何DNA模板，結(jié)果顯示對(duì)照組無條帶，表明本體系無外源DNA的干擾。

3.3 引物特異性檢驗(yàn)

為檢驗(yàn)本PCR體系的檢驗(yàn)精度，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行人為污染設(shè)置，即將不同濃度的葡糖桿菌接種于未污染的酸奶中，最終得到葡糖桿菌濃度為3×105CFU/mL、2×105CFU/mL、1×105CFU/mL、0.5×105CFU/mL、0.1×105CFU/mL五種不同濃度的葡糖桿菌接種的1-5號(hào)樣品。

2：自制純酸奶3：人工接種葡糖桿菌的酸奶

分別將具有不同葡糖桿菌濃度的酸奶提取的DNA，以總基因?yàn)槟０?，運(yùn)用PCR技術(shù)及膠體電泳檢測(cè)，如圖2。PCR結(jié)果顯示，隨著樣品中葡糖桿菌含量的減少，PCR擴(kuò)增條帶亮度依次減弱，表明引物靈敏，且能檢測(cè)濃度為0.5×105CFU/mL以上的葡糖桿菌含量。

3.4 酸奶放置時(shí)間對(duì)葡糖桿菌含量的影響

本實(shí)驗(yàn)選取滅菌的自制酸奶，開蓋放置在室內(nèi)，在放置0h、4h、8h、16h、24h后取樣， 提取樣品的全基因組，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3。結(jié)果表明隨開蓋時(shí)間的增加，酸奶中葡糖桿菌的數(shù)量也在增大，酸奶開蓋之后為了保證飲用安全，需盡快飲用。[LL]

4 結(jié)論

隨著人們安全意識(shí)的提高，酸奶的安全性問題越來越受到人們的重視，建立一種及時(shí)有效的檢測(cè)酸奶中葡糖桿菌對(duì)消費(fèi)者具有重要的意義。本文表明采用PCR方法可快速檢測(cè)酸奶中葡糖桿菌，操作簡(jiǎn)便、直接、節(jié)省樣本。

參考文獻(xiàn)

[1] 馬志英. 酸奶你喝對(duì)了嗎[J]. 質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)化，2018，09（5）：36-37.

[2] 韓千慧，劉丹丹，望詩琪，等. 褐色酸奶產(chǎn)品品質(zhì)的評(píng)價(jià)[J]. 中國乳品工業(yè)，2018，08（2）：51-54.

[3] 黃永紅，尤宏，王錫波.酸奶變質(zhì)的污染菌群分析[J]. 中國乳業(yè)，2002，02（2）：21.

[4] 王蕾，高領(lǐng).酸奶污染菌群的檢測(cè)試驗(yàn)[J]. 鄭州牧業(yè)工程高等專科學(xué)校學(xué)報(bào)，2008，28（1）：33.

[5] 王揚(yáng)，李宏，張建利.醋酸菌分類概要[J]. 中國釀造， 1991， 46（6）：7-10.

[6]吳燕濤，劉曉莉，王立平.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定發(fā)酵乳中雙歧桿菌[J].食品科學(xué)，2013（08）：172-175.

[7]黃留玉.PCR最新技術(shù)原理、方法及應(yīng)用[M].化學(xué)工業(yè)出版社，2011.

[8]吳擁軍，王嘉福.應(yīng)用16SrDNA鑒定食品中的雙歧桿菌[J].食品科學(xué)，2009，30（18）： 359-361.

[9]王超，孟祥晨.分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR法快速檢測(cè)雙歧桿菌的研究[J].微生物學(xué)通報(bào)，2007，34（6）：1163-1168.

[10] 李月華，周巍，楊嵐.葡糖桿菌的SYBR Green Ι熒光定量PCR方法的建立[J]. 現(xiàn)代食品科技，2015，24（4）：272-276.

作者簡(jiǎn)介：

趙丹（1986-），男，講師。研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。