hsa-miR-448過表達下調HIF-1α對結腸癌細胞SW480作用及機制研究①

歧紅陽 王云溪 肖占宇 王志民 吳鳳麗 董志超 王 蕾

(新鄉市中心醫院消化內科，新鄉 453000)

結腸癌是全球常見的消化道惡性腫瘤，發病率居惡性腫瘤的第3位，并且有逐年升高的趨勢[1,2]。雖然近年來對結直腸癌的普查力度在不斷加強，手術方式也在不斷改進，但其 5 年生存率還是不足60%[3,4]。因此，加強結腸癌預防和治療有效靶點的研究，是當今結直腸癌研究領域的熱點。最早在牛肺泡巨噬細胞中發現了小RNA-448(microRNA-448,miR-448)，并推測其與細胞的免疫應答及增殖、凋亡密切相關[5]。近幾年國內外關于miR-448的報道日益增多，我國最早報道miR-448與腫瘤的關系是在阿奇霉素化療乳腺癌后，發現阿奇霉素化療乳腺癌使乳腺癌細胞中miR-448的表達顯著下調，導致miR-448的靶基因SATB1表達上調，從而引起Twistl表達升高，并激活NF-κB信號通路，最終引起化療誘導腫瘤細胞上皮間質轉化的發生[6]。現已有研究表明miR-448在乳腺癌、膀胱癌、骨肉瘤和口腔鱗狀細胞癌等疾病的發生發展中發揮著重要作用[7-10]，但miR-448在結腸癌中的作用尚不清楚。本研究旨在探討miR-448在結腸癌發生和發展中的作用，及其潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 結腸癌細胞SW480購自ATCC，胎牛血清購自德國PAN公司，RPMI1640培養基購于美國 Hyclone 公司，Lipofectamine 2000 購于美國 Invitrogen 公司，雙熒光酶報告基因檢測試劑盒購于美國 Promega 公司，Transwell小室購自美國 Corning 公司，SB203580購自北京百奧萊博科技有限公司，miR-448 mimic、miR-448 inhibitor和pcDNA-HIF-1α質粒由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2方法

1.2.1靶基因預測 運用三個在線基因預測軟件：miRanda(http://www.microna.org/microrna/home.do)、TarBase (http://diana.calab.ece.ntua.gr/tarbase)、TargetScan (http://www.targetscan.org)，預測miR-448的下游靶基因。

1.2.2實驗分組說明 Ctrl組是正常結腸癌細胞SW480；miR-448 mimic組是轉染miR-448 mimic的結腸癌細胞SW480；pcDNA-HIF-1α組是轉染pcDNA-HIF-1α的結腸癌細胞SW480；mimic+pcHIF-1α組是共轉miR-448 mimic和pcDNA-HIF-1α的結腸癌細胞SW480；miR-448 inhibitor組是轉染miR-448 inhibitor的結腸癌細胞SW480；SB203580組加入P38通路拮抗劑SB203580 10 μmol/L的結腸癌細胞SW480；inhibitor+ SB203580組是加入P38通路拮抗劑SB203580 10 μmol/L轉染miR-448 inhibitor的結腸癌細胞SW480。

1.2.3細胞培養及轉染 結腸癌細胞SW480在10% 胎牛血清、1% 青霉素-鏈霉素溶液的RMPI1640細胞培養體系中，于5%CO2、37℃恒溫培養。利用Lipofectamine 2000進行轉染，miR-448 mimic與pcDNA-HIF-1α單獨或聯合轉染SW480細胞：首先，轉染前一天24孔板每孔接種SW480細胞于500 μl無抗生素的培養基，在轉染時細胞長至90%～95% 融合；然后，將稀釋好的質粒和Lipofectamine 2000混勻，室溫放置20 min；接著，每孔細胞加入100 μl轉染液，37℃ 培養18 h后檢測基因表達。

1.2.4RT-PCR 用Trizol試劑提取細胞或組織的總RNA，按試劑盒說明逆轉錄為cDNA，進行RT-PCR檢測。反應條件為：98℃ 預變性30 s；98℃ 變性10 s，56℃ 退火30 s，72℃延伸 10 s，共 40 個循環；4℃ 保存。引物序列：miR-448 正向引物序列為：5′-TTGCATATGTAGGATGTCCCAT-3′；miR-448 反向引物序列為：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGG-CAATTC-3′;HIF-1α正向引物序列： 5′-CGTTCCTTCGATCAGTTGTC-3′，HIF-1α反向引物序列5′-TCAGTGGTGGCAGTGGTAGT-3′。β-actin作為內參，應用凝膠成像系統(Bio-Rad)攝影，Quantity One 軟件進行掃描分析，計算采用2-ΔΔCt法。

1.2.5免疫印跡實驗 細胞裂解變性后取30 μg總蛋白，經10% SDS-PAGE后轉印至 PVDF膜后,用 5% 脫脂奶粉室溫封閉 1 h,加入兔抗人 E-cadherin (1∶1 000)、兔抗人Vimentin (1∶2 000)和鼠抗人 β-actin(1∶5 000),4℃孵育過夜,用 PBS 洗膜后加入山羊抗兔(1∶3 000)或山羊抗鼠二抗(1∶3 000)室溫孵育 1 h 后,加入 ECL曝光。

1.2.6熒光素酶報告基因實驗 用miR-448 mimic、HIF-1α wt和HIF-1α mut分別或同時對細胞進行轉染，以海腎熒光素酶的熒光值作為內參，按照Dual Luciferase報告基因試劑盒說明書進行。

1.2.7Transwell檢測 接種膠細胞懸液于鋪的小室上室(100 μl/室)，細胞終濃度為8×104個/室，另向下室加入750 μl 含血清培養基。培養48 h后取出Transwell 小室，結晶紫染色，顯微鏡下隨機選取5個視野拍照，收集試驗數據分析。

1.2.8劃痕實驗 將各組細胞消化鋪滿單層后用小號槍頭垂直劃痕。分別于24、48和72 h顯微鏡下拍照，用Image J軟件分析，細胞相對遷移距離=(D處理組-D對照組)/2。

1.2.9體內實驗 在裸鼠右后肢腹側皮下注射0.2 ml的1×107個/ml腫瘤細胞懸液，依據注射細胞不同，分為兩組：Ctrl組和miR-448 mimic組，每組20只，雌雄各半。術后繼續在SPF條件下飼養，正常飲食，觀察裸鼠皮下成瘤情況，第30天頸椎脫位法處死裸鼠，完整取出皮下移植瘤，電子天平稱重。組織標本于離體30 min 內保存，一半置于液氮中凍存，一半置于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.2.10免疫組化檢測Vimentin 的表達 移植瘤經常規10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，脫蠟水化，過氧化物酶阻斷內源性過氧化物酶活性，非免疫性動物血清阻斷非特異性反應，分別加入鼠抗人Vimentin單抗，4℃過夜，滴加生物素標記二抗，DAB顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片觀察統計。

2 結果

2.1miR-448直接抑制HIF-1α的表達 通過上述3種基因預測軟件篩選出HIF-1α作為miR-448的下游靶基因，miR-448與HIF-1α在3′UTR區存在結合位點(圖1A)。RT-PCR檢測miR-448的表達結果表明： miR-448 mimic組與Ctrl組相比，miR-448表達量顯著增高，說明miR-448 mimic有效;pcDNA-HIF-1α組與Ctrl組相比，miR-448表達量顯著降低，HIF-1α對miR-448表達具有負調節作用；同時轉染mimic+pcHIF-1α組的miR-448表達量，比Ctrl組的增高，比miR-448 mimic組顯著降低，比pcDNA-HIF-1α組顯著增高，說明miR-448和HIF-1α存在靶向關系，并且HIF-1α抑制miR-448表達(P<0.01,圖1B)。

為了進一步確定其靶向關系，用Western blot檢測HIF-1α的表達量。結果表明： miR-448 mimic組與Ctrl組相比，HIF-1α表達量顯著降低，說明miR-448能夠抑制HIF-1α表達;pcDNA-HIF-1α組與Ctrl組相比，HIF-1α表達量顯著增高，這說明pcDNA-HIF-1α質粒有效;mimic+pcHIF-1α的HIF-1α表達量，比Ctrl組的降低，比miR-448 mimic組顯著增高，比pcDNA-HIF-1α組顯著降低，說明miR-448和HIF-1α存在靶向關系，并且miR-448對HIF-1α表達具有抑制作用(P<0.01,圖1C)。

為了進一步驗證miR-448直接作用于HIF-1α，進行了熒光素酶報告基因實驗。結果表明：miR-448對野生型HIF-1α表達有明顯下調作用，對突變型沒有明顯作用(P<0.01,圖1D)，提示miR-448直接靶向作用于HIF-1α。

2.2過表達miR-448抑制SW480細胞侵襲和遷移 由Transwell檢測結果表明：miR-448 mimic組比Ctrl組細胞侵襲數目顯著減少，說明過表達miR-448可以降低SW480細胞侵襲能力；pcDNA-HIF-1α組比Ctrl組細胞侵襲數目顯著增多，說明過表達HIF-1α可以增強SW480細胞侵襲能力；mimic+pcHIF-1α組細胞侵襲數目，比Ctrl組相對減少，比miR-448 mimic組顯著增多，比pcDNA-HIF-1α組顯著減少，這說明過表達miR-448通過抑制HIF-1α來降低SW480細胞侵襲能力(P<0.01,圖2A)。由劃痕實驗結果表明：miR-448 mimic組比Ctrl組劃痕寬，愈合率顯著降低說明過表達miR-448可以降低SW480細胞遷移能力；pcDNA-HIF-1α組比Ctrl組細劃痕窄，愈合率顯著升高，說明過表達HIF-1α可以增強SW480細胞遷移能力；mimic+pcHIF-1α組劃痕，比Ctrl組劃痕寬、愈合率降低，比miR-448 mimic組劃痕窄、愈合率顯著升高，比pcDNA-HIF-1α組劃痕寬、愈合率降低，這說明過表達miR-448通過抑制HIF-1α來降低SW480細胞遷移能力(P<0.01,圖2B)。

圖1 miR-448直接抑制HIF-1α的表達Fig.1 miR-448 directly inhibits expression of HIF-1αNote: A.The binding site of miR-448 and HIF-1α in the 3′UTR region was detected by TargetScan;B.The expression of miR-448 was detected by RT-PCR;C.The expression of HIF-1α protein was detected by Western blot;D.Luciferase activity assay results;compared with the control group,**.P<0.01;compared with the single transfection group,##.P<0.01.

2.3過表達miR-448對上皮-間質細胞轉化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)影響 通過顯微觀察發現:miR-448 mimic組比Ctrl組細胞排列緊密，說明過表達miR-448抑制上皮細胞向間質細胞轉化；pcDNA-HIF-1α組比Ctrl組排列疏松，說明過表達HIF-1α可以促進上皮細胞向間質細胞轉化；mimic+pcHIF-1α組細胞，比Ctrl組排列緊密，比miR-448 mimic組排列疏松，比pcDNA-HIF-1α組排列緊密，這說明過表達miR-448通過抑制HIF-1α來抑制上皮細胞向間質細胞轉化，從而降低SW480細胞遷移(圖3A)。

通過Western blot檢測結果表示：miR-448mimic組與Ctrl組相比，E-cadherin顯著上調，Vimentin和N-cadherin顯著下調，說明過表達miR-448抑制上皮細胞向間質細胞轉化；pcDNA-HIF-1α組與Ctrl組相比，E-cadherin顯著下調，Vimentin和N-cadherin顯著上調，說明過表達HIF-1α可以促進上皮細胞向間質細胞轉化；mimic+pcHIF-1α組與比Ctrl組相比，E-cadherin顯著上調，Vimentin和N-cadherin顯著下調；mimic+pcHIF-1α組與miR-448 mimic組相比，E-cadherin顯著下調，Vimentin和N-cadherin顯著上調；mimic+pcHIF-1α組與pcDNA-HIF-1α組相比，E-cadherin顯著上調，Vimentin和N-cadherin顯著下調；這說明過表達miR-448通過抑制HIF-1α來抑制上皮細胞向間質細胞轉化，從而降低SW480細胞遷移(圖3B)。這與顯微觀察結果是相一致的。

圖2 各組細胞侵襲、遷移能力Fig.2 Invasion and migration ability of each group of cellsNote: A.Transwell was used to detect the invasive ability of each group;B.The migration ability of each group was tested by scratch test;compared with the control group,**.P<0.01;compared with the single transfection group,##.P<0.01.

2.4miR-448下調P38通路 RT-PCR檢測miR-448的表達結果表明：miR-448 inhibitor組與Ctrl組相比，miR-448表達量顯著降低，說明miR-448 inhibitor能夠下調miR-448的表達；SB203580組與Ctrl組相比，miR-448表達量顯著增高，說明SB203580可以上調miR-448表達；inhibitor+ SB203580組的miR-448表達量，比Ctrl組的降低，比miR-448 inhibitor組顯著增高，比pcDNA-HIF-1α組顯著降低，說明miR-448可以上調P38通路(P<0.01,圖4A)。

Western blot檢測結果表示： miR-448 inhibitor組與Ctrl組相比，HIF-1α、 P38和Hsp27的蛋白表達量顯著增高，說明低表達miR-448能夠上調HIF-1α、 P38和Hsp27的表達；SB203580組與Ctrl組相比，miR-448表達量顯著降低，說明SB203580可以下調HIF-1α、 P38和Hsp27表達；inhibitor+SB203580組的HIF-1α、 P38和Hsp27表達量，比Ctrl組的升高，比miR-448 inhibitor組顯著降低，比pcDNA-HIF-1α組顯著增高，說明低表達miR-448可以上調HIF-1α、 P38和Hsp27，從而上調P38通路(P<0.01,圖4B)。

圖3 各組上皮-間質細胞轉化情況Fig.3 Epithelial-mesenchymal cell transformation in each groupNote: A.Observe the morphology of each group of cells with microscope;B.Detect the expression of E-cadherin,Vimentin,N-cadherin by Western blot;compared with the control group,**.P<0.01;compared with the single transfection group,##.P<0.01.

由Transwell檢測結果表明：miR-448 inhibitor組與Ctrl組相比，細胞侵襲數目明顯增加，說明低表達miR-448可以增強SW480細胞侵襲能力；SB203580組與Ctrl組相比，細胞侵襲數目明顯減少，說明低表達SB203580可以減弱SW480細胞侵襲能力;inhibitor+SB203580組的細胞侵襲數目，比Ctrl組的少，比miR-448 inhibitor組明顯減少，比pcDNA-HIF-1α組明顯增多，說明低表達miR-448可以下調P38通路從而增強細胞的侵襲能力(P<0.01,圖4C)。

2.5過表達 miR-448抑制體內腫瘤生長 30 d后統計發現miR-448 mimic組的腫瘤重量約是Ctrl組腫瘤重量的37%，這說明miR-448可以抑制腫瘤的生長(圖5A)。

圖4 miR-448上調P38通路驗證Fig.4 Verify that miR-448 can up-regulate P38 pathNote: A.The expression level of miR-448 was detected by RT-PCR;B.The expression of HIF-1α,P38 and Hsp27 was detected by Western blot;C.The invasive ability of each group of cells was detected by Transwell;compared with the control group,**.P<0.01;compared with the single transfection group,##.P<0.01.

RT-PCR檢測miR-448和HIF-1α的表達結果表明：與Ctrl組相比，miR-448 mimic組miR-448表達量顯著降低，HIF-1α表達量顯著增高，這說明過表達miR-448可以下調小鼠腫瘤細胞miR-448的表達，上調小鼠腫瘤細胞HIF-1α的表達，說明miR-448通過抑制HIF-1α表達，從而抑制腫瘤的生長(圖5B)。

Western blot檢測HIF-1α、P38和Hsp27結果表明：與Ctrl組相比，miR-448 mimic組HIF-1α、P38和Hsp27表達量顯著下調，這與體外實驗結果相一致(圖5C)。

免疫組化檢測Vimentin的表達結果表明： miR-448 mimic組細胞Vimentin陽性比率明顯低于Ctrl組，這說明過表達miR-448下調Vimentin 的表達(圖5D)。

圖5 各組小鼠腫瘤生長情況Fig.5 Tumor growth in each group of miceNote: A.Tumor weight statistics of each group of mice;B.The expression of miR-448 and HIF-1α was detected by RT-PCR;C.Western blot was used to detect the expression of HIF-1α,P38 and Hsp27;D.Detection of Vimentin expression by immunohistochemistry;compared with the control group(×400),**.P<0.01.

3 討論

結腸癌極易發生侵襲、轉移，確診時多伴有局部和遠處的侵襲、轉移。因此，調控結腸癌的侵襲、轉移是研究的熱點。而miRNA的表達異常與癌癥的發生、侵襲轉移密切相關，其在癌癥發生發展過程中扮演著抑癌基因或致癌基因的角色[11]，是癌癥診斷、治療新的作用位點。

miR-448是近期癌癥靶點研究的一個熱點：Cheng等[11]發現miR-448通過抑制非小細胞肺癌細胞增殖、侵襲、遷移和上皮-間質轉化來抑制非小細胞肺癌的形成和發展；Wang等[12]發現miR-448通過抑制Bcl-2基因表達來促進膀胱癌細胞凋亡，抑制膀胱癌細胞增殖；Bamodu等[13]發現下調hsa-miR-448使KDM5異常表達，從而可以提高乳腺癌細胞的侵襲能力；Su等[14]發現膠質瘤潛在的治療靶點miR-448能夠通過下調CTTN來抑制膠質瘤細胞增殖，促進膠質瘤細胞的凋亡；Jin等[15]發現miR-448胰腺癌負調控Rab2B來促進胰腺癌細胞凋亡。但miR-448在結腸癌發生和發展中的作用并未見報道。

本文通過RT-PCR、Western blot和熒光素實驗發現miR-448在結腸癌中靶向作用于HIF-1α，并對其呈負調控。Nagaraju等[16]研究指出乳腺癌、肺癌、結腸癌等腫瘤存在HIF-1α的高表達。并已有研究表明，HIF-1α能促進腫瘤的侵襲、轉移，在腫瘤的形成和發展中起著關鍵作用[17]。因此，預測在結腸癌中miR-448能夠下調HIF-1α，從而抑制結腸癌的發生和發展。通過Transwell和劃痕實驗，證實了上述預測，發現過表達miR-448下調HIF-1α可以降低SW480細胞侵襲、遷移能力。

EMT是緊密連接的上皮細胞向組織松散、缺乏細胞連接和細胞極性的間質細胞的轉化。而極性的喪失、黏附性降低、遷移能力增強，這些正是腫瘤細胞的特征。EMT在結腸癌的侵襲、遷移中發揮重要作用，是結腸癌細胞侵襲遷移的重要機制[18]。EMT的實質是調控肌動蛋白絲的動態裝配，因此，上皮標志物(E-cadherin) 的表達下調，而間質標志物(N-cadherin、Vimentin) 的表達上調被認為是腫瘤細胞獲得 EMT 的重要標志[19,20]。本文通過Western blot檢測上皮性標記E-cadherin和間充質標記蛋白Vimentin、N-cadherin發現過表達miR-448下調HIF-1α來抑制上皮細胞向間質細胞轉化，從而降低SW480細胞侵襲遷移能力。

細胞對外界刺激的調節是通過細胞內信號傳導途徑來控制的。P38信號通路在腫瘤的增殖、侵襲和轉移中起著重要的調節作用[21-23]，而HIF-1α表達量的增加是依賴其上游的P38MAPK信號通路的活化[24]。為了更好地了解miR-448在結腸癌中的作用及其機制，構建 miR-448抑制物和P38抑制物SB203580組。通過RT-PCR預測到在結腸癌細胞中miR-448可以下調P38通路。通過Western blot檢測P38通路相關蛋白HIF-1α、 P38和Hsp27蛋白表達量發現在結腸癌細胞中miR-448能夠顯著下調HIF-1α、 P38和Hsp27表達。Transwell實驗發現在結腸癌細胞中miR-448通過下調P38通路來減弱細胞的侵襲能力。

通過體外實驗，我們發現hsa-miR-448過表達下調HIF-1α減弱結腸癌細胞SW480侵襲和遷移、抑制上皮-間質轉化。裸鼠體內實驗發現過表達miR-448抑制結腸癌的生長，這和前面體外實驗的結果相一致。RT-PCR檢測發現過表達miR-448下調HIF-1α，Western blot檢測發現HIF-1α、P38和Hsp27表達量顯著下調，這與體外實驗結果相一致。Vimentin在正常上皮細胞中不表達，在間充質細胞和外胚層細胞表達，可以作為癌癥分化起源的特異性標記物[25]。本研究通過免疫組化檢測發現過表達miR-448下調Vimentin 的表達，說明過表達miR-448抑制上皮間質轉化。

綜上所述，在結腸癌細胞SW480中，過表達hsa-miR-448通過P38通路下調HIF-1α來減弱細胞的侵襲遷移能力以及抑制上皮間質轉化，從而抑制結腸癌的發生和發展。miR-448可以成為結腸癌診斷、 治療以及預后評估的潛在候選靶點。