微小RNA-600在卵巢癌組織的表達及其靶向調控對氧磷酶3對卵巢癌細胞株OVCAR-3侵襲和遷移的影響①

李 航 楊 蝶 劉慧芝

(遵義醫科大學附屬醫院醫務處,遵義 563003 )

卵巢癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一[1]。盡管在過去數十年中卵巢癌的臨床治療策略有了顯著改善，但其5年生存率仍較低，約為35%～38%[2]。至今，關于卵巢癌的潛在發展機制尚不完全清楚。因此，闡明卵巢癌發生和進展的具體機制對于臨床開展新的診療方案至關重要。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類進化上高度保守的非編碼RNA，通過與靶基因3′非翻譯區結合，在轉錄后水平調節靶基因的表達[3]。基于調控靶蛋白的功能，miRNA在腫瘤的多種生物學過程中發揮作用，包括有細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移等，進而在腫瘤發生中扮演致癌或腫瘤抑制功能，并有望成為卵巢癌的潛在治療靶標[4,5]。

miRNA-600是一種癌癥相關miRNA，在胃癌、急性白血病等不同癌癥中發揮抑癌作用[6，7]。然而，到目前為止，miRNA-600在卵巢癌的作用尚不清楚。因此，在本研究中，我們首先分析miRNA-600在卵巢癌及癌旁的表達情況，并分析其對卵巢癌侵襲和遷移中的影響及可能的機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 卵巢癌細胞系SKOV3、A2780、OVCAR-3、HO-8910和人卵巢表面上皮細胞系HOSEpiC均購自中國科學院上海生科院細胞資源中心；RPMI1640培養基購自美國Gibco-BRL公司；10%胎牛血清購自美國HyClone公司；miRNA-600模擬物、miRNA-600抑制劑、模擬物與抑制劑對照物均購自廣州復能基因有限公司；對氧磷酶3(Paraoxonase 3，PON3)及其對照載體等均購自美國Sigma公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；TRIzol、miRNA逆轉錄試劑盒、miRNA測定試劑盒均購自武漢生之源生物科技股份有限公司；引物序列購自武漢天一輝遠生物公司；Western blot所用PON3、E-鈣黏素、N-鈣黏素、基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)-2、MMP-9和GAPDH一抗及二抗均購自美國Abcam公司；免疫組化所用PON3、E-鈣黏素、N-鈣黏素、MMP-2、MMP-9一抗和二抗均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；雌性裸鼠購自吉林大學實驗動物中心。

1.1.2卵巢癌組織樣本收集 收集2017年1月至2018年10月我院婦產科經手術治療的卵巢癌患者共50例，年齡46～68歲，平均(58.7±7.2)歲，獲取50對癌及癌旁組織(距離癌組織>3 cm)。將組織樣品快速冷凍并儲存在液氮中用于進一步研究。卵巢癌患者納入與排除標準：①排除已接受免疫療法及化療或放療患者；②納入患者須獲得本人或直系家屬知情同意并簽署知情同意書；③排除既往有其他惡性腫瘤史者。卵巢癌分期根據2018年國際婦產科聯合會標準[8]。本次研究經院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1細胞系與細胞培養 SKOV3、A2780、OVCAR-3、HO-8910和HOSEpiC細胞系均在含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI1640培養基中生長，培養在37℃，5%CO2培養箱。

1.2.2細胞轉染 使用Lipofectamine 2000將miRNA-600模擬物、miRNA-600抑制劑、模擬物與抑制劑對照物、PON3及其對照載體等轉染到卵巢癌細胞。

1.2.3實時定量逆轉錄PCR(Real-time quantitative reverse transcription-PCR，qRT-PCR) 應用TRIzol法提取卵巢癌組織樣品和卵巢癌細胞中總RNA。使用miRNA逆轉錄試劑盒和miRNA測定試劑盒進行qRT-PCR測定。U6和GAPDH分別作為miRNA-600和PON3的內參。引物序列如下，miRNA-600正向：5′-CTGTGTGCCACACAGTTTG-3′，反向：5′-CGGCCCTTAACTCATTCTTT-3′；U6正向：5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，反向：5′-CAGGGGCCATGCTAATCTT-3′；PON3正向：5′-CTCGGCAGTGTGTGGGGTC-3′；反向：5′-CGAGAAACTCCTGCTTGGGG-3′；GAPDH正向：5′-ATTCCATGGCACCGTCAAGGC-TGA-3′；反向：5′-TTCTCCATGGTGGTGAAGACGC-CA-3′。應用2-ΔCT法進行相對表達量計算，每個樣本重復檢測3次。

1.2.4Western blot 使用RIPA裂解緩沖液提取細胞蛋白，并使用BCA試劑盒測量蛋白質濃度。在濃度為10%的SDS凝膠上加載并分離蛋白后，將細胞蛋白質轉移到PVDF膜上。將膜與PON3、E-鈣黏素、N-鈣黏素、MMP-2、MMP-9和GAPDH一抗4℃孵育過夜。將對應二抗與PVDF膜在室溫下孵育2 h。使用ECL試劑檢測目的蛋白質的表達水平。

1.2.5細胞遷移和侵襲測定 為了確定卵巢癌細胞的遷移能力，通過將相應轉染處理的細胞(1×105個/孔)加至6孔板中進行劃痕試驗測定。隨后，用無菌塑料微量移液管尖端在細胞單層中創建一個均勻的劃痕。用PBS洗滌細胞并在37℃，5%CO2條件下培養24 h。然后，用倒置相差顯微鏡在劃痕后0 h和24 h對細胞進行成像。采用Image J軟件測量劃痕后兩條細胞邊緣之間的垂直距離，計算細胞24 h遷移率，遷移率(%)=(0 h劃痕間距-24 h劃痕間距)/0 h劃痕間距×100%。

使用Transwell實驗測定細胞侵襲能力。將無血清培養基中的2×105個細胞接種到涂有基質膠的上室中。在下室中加入含有10%FBS的RPMI1640培養基作為化學引誘劑。24 h后，用棉簽輕輕除去上室中非侵入細胞，并用70%乙醇固定侵入基質膠的細胞30 min，經0.1%結晶紫染色10 min。用倒置光學顯微鏡以200×放大倍數視野中拍攝細胞，并在5個隨機視野中計算細胞數量。

1.2.6免疫組織化學染色 將石蠟切片(約4 μm厚度)進行脫蠟并通過二甲苯和梯度乙醇再水合，放置于3%過氧化氫一起溫育10 min以淬滅內源性過氧化物酶活性。然后，在室溫下用山羊血清封閉1 h，并與PON3、E-鈣黏素、N-鈣黏素、MMP-2、MMP-9單克隆抗體一起溫育，4℃過夜。堿性磷酸酶二抗室溫孵育1 h。最后，用二氨基聯苯胺染色切片，然后蘇木精染色。應用ImagePro Plus對免疫組化結果進行分析，并按陽性細胞百分比及陽性細胞染色強弱評分。免疫組織化學評分=a×b，a代表陽性細胞百分比(a=0，無陽性細胞；a=1，陽性細胞為1%～10%；a=2，陽性細胞為11%～50%；a=3，陽性細胞為51%～80%，a=4陽性細胞所占比例達81%以上),b代表陽性細胞染色強弱(b=0，陰性；b=1，弱陽性；b=2，中度陽性；b=3，強陽性)。

1.2.7熒光素酶報告基因測定 為研究miRNA-600是否與PON3的3′非翻譯區相互作用，進行了熒光素酶報告基因測定。將PON3的3′非翻譯區序列或突變序列克隆到pMIR-REPORT載體中。將miRNA-600模擬物或相應的對照與報告質粒和pRL-SV40一起轉染到卵巢癌細胞中。48 h后測定熒光素酶活性水平。

1.2.8裸鼠體內實驗 對于腫瘤轉移實驗，將經轉染處理的約2×106個細胞于腹膜內注射至6～8周齡的雌性裸鼠中。3周后處死小鼠并計數腹膜內腫瘤結節。收獲每只小鼠的結節用于qRT-PCR和免疫組織化學染色。

2 結果

2.1miRNA-600在卵巢癌組織及細胞系的表達情況 與癌旁組織相比，癌組織中miRNA-600的相對表達量顯著降低(6.11±1.15 vs 3.81±0.69，t=7.139，P<0.05)，見圖1A。且Ⅲ～Ⅳ和發生淋巴結轉移的卵巢癌患者組織中miRNA-600水平顯著低于Ⅰ～Ⅱ和未發生淋巴結轉移者(P<0.05)，見表1。與HOSEpiC(8.13±0.52)相比，SKOV3(4.06±0.11)、 A2780(3.87±0.35)、 OVCAR-3(2.18±0.17)、HO-8910(3.04±0.42)中miRNA-600的相對表達量均顯著降低(t=8.225、8.470、11.013、9.264，P<0.05)，且在OVCAR-3細胞中降低最為顯著，故選擇OVCAR-3進行后續實驗，見圖1B。

圖1 卵巢癌組織及細胞系中miRNA-600的表達水平Fig.1 Expression levels of miRNA-600 in ovarian cancer tissues and cell linesNote: *.P<0.05.

表1 miRNA-600表達水平與卵巢癌臨床病理學特征之間的關聯

Tab.1 Association between miRNA-600 expression levels and clinical pathological features of ovarian cancer

Clinical pathologicalfeaturesnRelative expression of miRNA-600x±stPAge(year)1.2390.407>60233.95±0.70≤60273.69±0.63Tumor size1.0970.762>5 cm373.87±0.65≤5 cm133.64±0.67Staging5.1940.003Ⅰ-Ⅱ354.19±0.75Ⅲ-Ⅳ152.93±0.46Lymph node metastasis-6.3970.001Yes122.73±0.52No384.15±0.74

2.2過表達miRNA-600可抑制OVCAR-3細胞侵襲與轉移 與模擬物對照[miRNA-600：2.13±0.18；N-鈣黏素：4.78±0.69；E-鈣黏素：2.07±0.24；MMP-2：5.16±0.73；MMP-9：4.44±0.62；遷移率：(73.45±5.18)%；細胞侵襲數量：47.22±6.90]相比，miRNA-600模擬物[miRNA-600：7.88±0.69；N-鈣黏素：2.21±0.45；E-鈣黏素：4.67±0.20；MMP-2：2.04±0.12；MMP-9：2.39±0.20；遷移率：(37.63±3.76)%；細胞侵襲數量：19.34±4.63]的miRNA-600與E-鈣黏素顯著增高，而N-鈣黏素、MMP-2、MMP-9、遷移率和細胞侵襲數量顯著降低(P<0.05)；與抑制劑對照[miRNA-600：2.15±0.19；N-鈣黏素：1.89±0.22；E-鈣黏素：4.92±0.42；MMP-2：1.76±0.09； MMP-9： 1.88±0.12； 遷移率：(41.45±3.97)%；細胞侵襲數量：41.56±7.98]相比，miRNA-600抑制劑[miRNA-600：0.26±0.08；N-鈣黏素：4.67±0.60；E-鈣黏素：1.85±0.07；MMP-2：4.38±0.57；MMP-9：4.55±0.60；遷移率：(84.12±6.50)%；細胞侵襲數量：62.89±9.57]的miRNA-600與E-鈣黏素顯著降低，而N-鈣黏素、MMP-2、MMP-9、遷移率和細胞侵襲數量顯著增高(P<0.05)，見圖2。

圖2 miRNA-600抑制OVCAR-3細胞的侵襲與轉移Fig.2 miRNA-600 inhibits invasion and metastasis of OVCAR-3 cellsNote: A.miRNA-600 transfection effect;B.E-cadherin,N-cadherin,MMP-2,MMP-9 protein levels in different transfection groups;C，D.Cell migration ability between different transfection groups;E，F.Cell invasion ability between different transfection groups.

2.3PON3介導miRNA-600對OVCAR-3細胞侵襲與轉移功能的影響 TargetScan預測PON3是miRNA-600的靶基因，且該結果在雙熒光素酶報告基因檢測中也得以驗證，見圖3A、B。與模擬物對照(PON3 mRNA：6.62±0.73；PON3蛋白：14.36±1.47)相比，miRNA-600模擬物(PON3 mRNA：2.22±0.26；PON3蛋白：2.65±0.29)的PON3 mRNA與蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，與抑制劑對照(PON3 mRNA：5.96±0.94；PON3蛋白：10.13±1.34)相比，miRNA-600抑制劑(PON3 mRNA：8.98±1.54；PON3蛋白：18.76±1.98)的PON3 mRNA與蛋白水平均顯著增高(P<0.05)，見圖3C、F。

與模擬物對照[遷移率：(46.45±3.88)%；細胞侵襲數量：49.76±4.26]相比，miRNA-600模擬物[遷移率：(22.09±1.68)%； 細胞侵襲數量：26.17±3.40]的OVCAR-3細胞遷移率和細胞侵襲數量均顯著降低(P<0.05)，PON3載體[遷移率：(92.11±6.05)%；細胞侵襲數量：77.04±7.64]的OVCAR-3細胞遷移率和細胞侵襲數量均顯著增高(P<0.05)，而miRNA-600模擬物聯合PON3載體[遷移率：(55.09±4.16)%；細胞侵襲數量：52.36±5.37]OVCAR-3細胞遷移率和細胞侵襲數量差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3D、E。

圖3 PON3與miRNA-600的靶向關系驗證Fig.3 PON3 and miRNA-600 targeting relationship verificationNote: A.TargetScan predicts miRNA-600 target gene;B.Dual luciferase reporter gene test results;C.miRNA-600 targets and regulates the expression of PON3 mRNA;D.miRNA-600 inhibits migration of OVCAR-3 cells by down-regulating PON3;E.miRNA-600 inhibits OVCAR-3 cell invasion by down-regulating PON3;F.miRNA-600 targets and regulates the expression of PON3 protein.*.P<0.05.

圖4 miRNA-600可抑制裸鼠卵巢癌細胞的轉移及PON3表達Fig.4 miRNA-600 inhibits metastasis and PON3 expression in ovarian cancer cells in nude mice

2.4過表達miRNA-600可抑制裸鼠卵巢癌細胞的轉移 與模擬物對照[結節重量：(2.76±0.22)g；結節數量：(13.45±2.54)]相比，miRNA-600模擬物[結節重量：(0.69±0.08)g；結節數量：4.19±0.63]處理的裸鼠腹腔內腫瘤轉移結節重量和數量均顯著降低(P<0.05)。免疫組織化學染色結果顯示，與模擬物對照(9.76±0.91)相比，miRNA-600模擬物(1.84±0.16)處理的裸鼠結節中PON3的免疫組化評分顯著降低(P<0.05)。

3 討論

前期多篇報道指出miRNA在卵巢癌進展中起著至關重要的作用[4，5]。在本研究中，我們探討了miRNA-600在卵巢癌中的作用，發現在卵巢癌組織和細胞系中miRNA-600分別比正常卵巢組織和細胞系顯著下調。此外，Ⅲ～Ⅳ和發生淋巴結轉移的卵巢癌患者組織中miRNA-600水平顯著低于Ⅰ～Ⅱ和未發生淋巴結轉移者。miRNA-600可通過下調PON3表達促進E-鈣黏素表達，并下調N-鈣黏素、MMP-2、MMP-9表達，進而抑制卵巢癌細胞的遷移和侵襲，并可降低異種移植裸鼠腹腔腫瘤轉移的數量和腫瘤大小。

E-鈣黏素和N-鈣黏素是評估腫瘤細胞遷移能力的兩個重要分子標志物，E-鈣黏素是轉移抑制分子，其水平增高將降低癌細胞的遷移能力[9]；N-鈣黏素則與E-鈣黏素功能相反，其水平增高則會顯著促進癌細胞的遷移[10]。MMP-2和MMP-9是基質金屬蛋白酶家族的重要成員，兩者增高會促進腫瘤細胞的侵襲能力[11]。本實驗發現，miRNA-600能促進E-鈣黏素，并抑制N-鈣黏素、MMP-2和MMP-9表達，提示miRNA-600具有抑制卵巢癌細胞遷移與侵襲的功能。

PON3是分子量約為40 kD的糖蛋白，已被發現在多種腫瘤中過表達，并可通過在癌細胞中螯合泛半醌結構而減少腫瘤細胞線粒體中超氧化物的形成，進而提高腫瘤細胞的抗氧化能力，促進其遷移與侵襲[12]。本研究通過TargetScan軟件預測miRNA-600可直接靶向作用于PON3 mRNA的3′非翻譯區，從而抑制PON3 mRNA和蛋白表達水平。

綜上所述，miRNA-600可抑制卵巢癌OVCAR-3細胞遷移與侵襲能力，其機制與調控靶基因PON3密切相關。