葉酸介導阿霉素白蛋白納米粒的制備及細胞學研究

胡丹丹， 李 磊， 寧偎峰， 趙 瑩， 張琳琳， 胡櫟芳， 孟艷秋

(沈陽化工大學 制藥與生物工程學院， 遼寧 沈陽 110142)

阿霉素(Doxorubicin,DOX)，屬于蒽環類廣譜抗腫瘤抗生素，臨床常用其鹽酸鹽，也稱多柔比星，可對機體產生廣泛的生物學效應.阿霉素細胞毒性作用強烈，對肝癌、甲狀腺癌、淋巴癌、肺癌的療效好，對膀胱癌、支氣管癌也有一定的作用.但是，如果靜脈注射高劑量的DOX將會引起強烈的心臟及脊髓毒副作用，這些缺點成為限制DOX臨床應用的主要因素[1].為了提高DOX在體內的生物利用度，減少其毒副作用，增加藥物的穩定性，國內外的許多學者將其載于納米微粒、脂質體等藥物載體系統中，將小分子藥物與高分子載體采用納米技術相結合，利用配體與受體間的特異性親和作用，制成具有靶向性和緩釋性等優點的納米藥物，從而降低藥物的毒性與不良反應[2-3].Luten等[4]利用葉酸、聚乙二醇和聚環鄰腈制備了一種葉酸靶向載體，報告基因pCMVLacZ被包裹進入該葉酸靶向載體；對其進行的人卵巢癌OVCAR3細胞體外轉染實驗結果顯示，該葉酸復合物的轉染效率是無葉酸復合物的3倍，說明這是一種具有潛在開發價值的靶向性基因載體.Liang等[5]為了減小基因載體的毒性并優化其功能，利用聚乙二醇和聚乙烯亞胺既克服了轉染效率低，又高效地將質粒DNA(pDNA)濃聚到納米粒內部，制成了葉酸-聚乙二醇-聚乙烯亞胺/pDNA復合物，將異硫腈酸熒光素結合到這種復合物的氨基上，與葉酸受體陽性的人胚腎上皮細胞HEK293和人腦膠質瘤C6細胞共孵育，結果顯示腫瘤細胞顯著吞噬熒光物質.細胞實驗顯示該葉酸復合物毒性較低，葉酸復合物組轉染效率是無葉酸組的15倍，故葉酸是較為理想的靶向治療載藥系統.

本文以一種無免疫原性、生物可降解材料牛血清白蛋白為載體，將葉酸偶聯在其表面，制備載阿霉素的白蛋白納米粒.利用配體與受體間特異性親和作用制備高載藥量和高包封率的納米粒，并對其粒徑、釋放速率等性質進行考察；以阿霉素粉劑為對照，考察其體外抗腫瘤活性，為葉酸偶聯阿霉素白蛋白納米粒的進一步開發研制奠定基礎[6].

1 儀器和試劑

儀器：FA1204B電子分析天平，沈陽龍杰儀器有限公司；馬爾文激光粒度測試儀，馬爾文帕納科有限公司；MR700型酶聯免疫檢測儀，費爾伯恩精密儀器(上海)有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；高效液相色譜儀，安捷倫有限公司；DF-J01離心機、ZF7-熒光分光光度計，鞏義市英裕裕華儀器廠；透射電子顯微鏡，賽默飛世爾科技電子有限公司； JK-CI-50CH-CO2恒溫培養箱，上海精學科學儀器有限公司；KDQX-100超聲波清洗機，科電超聲有限公司；DF101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州科豐儀器有限公司；LIOO S600T-電子顯微鏡，費爾伯恩精密儀器有限公司.

試劑：牛血清白蛋白，上海金穗生物科技有限公司；葉酸Sigma，湖北鑫潤德化工有限公司；二環己基碳二亞胺( Acros)、N-羥基琥珀酰亞胺Sigma、胰蛋白酶、噻唑藍(MTT)、三乙胺、二甲基亞砜(DMSO)，天津博迪化工股份有限公司；人肝癌細胞(HEPG2)、人胃癌細胞(SGC7901)，沈陽藥科大學；磷酸鹽緩沖液(PBS)，自制.

2 方法

2.1 阿霉素白蛋白納米粒(BSANPs-DOX)的制備

稱量白蛋白100 mg和阿霉素1 mg加入1 mL水溶解，放入25 ℃的恒溫磁力攪拌器中攪拌2 h，用NaHCO3堿溶液調節溶液的pH為8～9，使用恒流泵將4 mL體積分數為95 %的乙醇在8 min內緩慢加入溶液中，加入體積分數8 %的戊二醛溶液20 μL，在室溫下進行交聯固化反應，固化完畢后，繼續攪拌12 h，調節離心機的轉速為15 000 r/min，高速離心10 min,傾去上清液，得到白蛋白納米粒懸液，超聲勻化10 min，過0.22 μm的濾膜，即可得到納米粒子[7].

2.2 葉酸活性酯的制備

準備0.5 mL的三乙胺，將其緩慢加入20 mL的二甲亞砜溶液中，靜置一會使其冷卻，在冷卻好的二甲亞砜溶液中加入1 mg的葉酸粉末，用玻璃棒緩慢攪拌使其溶解，加入適量的二環己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，在室溫下使其充分反應12 h.過濾后減壓濃縮成為干燥粉末狀物質，用2倍體積的乙醚將剩余雜質析出，得到淡黃色粉末，該淡黃色粉末即為葉酸活性酯.

2.3 葉酸偶聯阿霉素白蛋白納米粒(FA-BSANPs/DOX)的制備

葉酸活性酯上的羧基可以與牛血清白蛋白表面的氨基酸殘基上的氨基發生偶聯反應.取適量阿霉素白蛋白納米粒，用緩沖溶液調節pH至9，將之前制備好的黃色葉酸活性脂粉末溶解適量，加入混懸液中，攪拌均勻.用葡萄糖凝膠柱進行上柱分離，收集先流下來的白色光亮部分液體，即可得到葉酸偶聯阿霉素白蛋白納米粒(FA-BSANPs/DOX)混懸液[6].

2.4 葉酸偶聯載阿霉素白蛋白納米粒(FA-BSANPs/DOX)的性質

2.4.1 葉酸偶聯量的測定

①葉酸活性酯標準曲線測定：精密稱取定量的葉酸活性酯，用容量瓶定量配置成40 mg/L的溶液，并用容量瓶定量稀釋質量濃度分別為40、20、10、8、2 mg/L.全波長分光光度計檢測，繪制葉酸活性酯標準曲線.將FA-BSANPs/DOX用胰蛋白酶在37 ℃恒溫磁力攪拌器內水解4 h，參照葉酸活性酯標準曲線計算不同牛血清白蛋白上偶聯葉酸的量.②設置對照組，即未加胰蛋白酶水解的FA-BSANPs/DOX，其他條件均相同.用全波長分光光度計檢測樣品內葉酸的含量[8].

2.4.2 形態觀察

取FA-BSANPs/DOX適量，用蒸餾水稀釋后，滴于銅網上制樣，用濾紙吸去多余的液體，自然晾干，于透射電鏡下觀察其形態.

2.4.3 粒徑測定

取FA-BSANPs/DOX適量，用蒸餾水稀釋成適宜的濃度，采用馬爾文激光粒度儀測定粒徑及粒徑分布.

2.4.4 包封率和載藥量的測定

采用超濾法對游離DOX和FA-BSANPs/DOX進行分離.精密吸取FA-BSANPs/DOX樣品溶液0.15 mL于10 mL量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度.取稀釋后的樣品溶液于超濾裝置中進行超濾，收集續濾液.精密吸取稀釋后的樣品溶液和續濾液0.2 mL，利用柱前衍生化-高效液相色譜法分別測定游離藥物質量(m游)和納米?？偹幬镔|量(m總).按照中國藥典(2015版)固體脂質納米粒包封率的計算公式計算包封率

包封率ER=(m總-m游)/m總×100 %.

載藥量DL=(m總-m游)/mc×100 %.

式中：m總表示總藥物質量；m游表示游離藥物質量；mc為混合脂質質量.

2.5 體外釋放

取20 mg游離DOX和FA-BSANPs/DOX置于經過預處理的透析袋中，加入5 mL PBS緩沖液(pH=7.4),用透析夾夾緊，置于盛有300 mL PBS的大燒杯中，模擬體內環境在水浴箱中恒速震動(37 ℃,20 r/min).分別于0.5、1、3、5、8、12、24 h吸去1 mL釋放液，并及時補充等量恒溫的PBS釋放介質.用ELISA(酶聯免疫吸附測定)法測定不同時刻樣品上清液的光密度值，并根據前述標準曲線轉換成DOX含量，計算每次取樣時釋放的DOX總量.上述步驟重復6次，取其平均值，制作DOX納米粒體外釋放曲線[8-9].

2.6 體外藥效學研究

2.6.1 測試藥品的樣品配制

白蛋白納米粒溶液(BSANPs)：制備白蛋白納米粒質量濃度為20 g/mL的空白材料溶液，用細胞培養液稀釋至所需濃度，過0.22 μm濾膜.

阿霉素水溶液(DOX)：配制鹽酸阿霉素質量濃度為1 g/L的鹽酸阿霉素溶液，用細胞培養液稀釋至所需濃度，過0.22 μm濾膜.

葉酸偶聯阿霉素白蛋白納米粒(FA-BSANPs/DOX)：制備質量濃度為4 g/L的FA-BSANPs/DOX溶液，并用細胞培養液稀釋至所需濃度，過0.22 μm濾膜.

2.6.2 HEPG2細胞與SGC7901細胞的培養

配制含質量分數為10 %的胎牛血清、100 U/mL青霉素、質量分數為1 %非必需氨基酸的無菌DMEM培養基(培養箱：溫度37 ℃，CO2體積分數為5 %,飽和濕度，次日更換培養液)，將HEPG2細胞與SGC7901細胞置于其中進行培養.待培養液中的細胞覆蓋率達80 %～90 %時，吸去原有培養基，用PBS將細胞表面的培養液洗凈.取質量分數0.25 %胰蛋白酶消化單層培養的SGC7901(HepG2) 細胞，用質量分數為10 %的胎牛血清RPMI 1640培養液調整細胞數為2×104～4×104/mL的單細胞懸液，以每孔200 μL接種于96孔培養板中.將培養板放入CO2培養箱,在 37 ℃、體積分數為5 % CO2及飽和濕度條件下培養，等待細胞貼壁進行下一步實驗.

2.6.3 FA-BSANPs/DOX與DOX對HEPG2細胞和SGC7901細胞體外抗腫瘤活性[10-11]

根據前期預實驗，本次實驗所選用藥物的質量濃度梯度為33 mg/L、11 mg/L、3.6 mg/L、1.2 mg/L、0.4 mg/L.待培養細胞貼壁后，在96孔板中分別加質量濃度為33 mg/L、11 mg/L、3.6 mg/L、1.2 mg/L、0.4 mg/L的待測藥物DOX、BSANPs、FA-BSANPs/DOX，每濃度6個孔，實驗設空白對照組.將96孔板置于CO2培養箱，在37 ℃、體積分數為5 % CO2及飽和濕度條件下培養72 h.培養72 h后，孵育結束后取出96孔板，棄去培養液，每孔加入冷PBS 200 μL清洗，棄去PBS，每孔再加入MTT溶液(5 g/L 20 μL)，37 ℃繼續培養4 h，中止培養，離心棄去孔內上清液，每孔加入150 μL DMSO溶解甲臜沉淀，超聲振蕩10 min混勻.在MR700型酶聯免疫檢測儀上測定490 nm處各孔吸收度 (A) 值，計算各組相對細胞活度.按公式:抑制率=[1-(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)]×100 %.計算化合物抑制50 %細胞生成時的藥物濃度，即IC50值，重復測試3次，取平均值為最終結果.

3 結 果

3.1 葉酸偶聯量的測定

葉酸活性酯在281 nm處有最大吸收峰，如圖1所示，其中1、2和3分別為葉酸活性酯標準品、胰蛋白酶水解的FA-BSANPs/DOX樣品和未水解的FA-BSANPs/DOX樣品.由圖1可見：對照組樣品3中無游離葉酸存在，從而證明了水解組樣品中檢測出的葉酸是已被白蛋白偶聯的部分.

1 葉酸活性酯 2 胰酶水解的載阿霉素的葉酸-白蛋白納米粒3 胰酶未水解的葉酸偶聯阿霉素白蛋白納米粒 圖1 葉酸活性酯紫外光譜Fig.1 Ultraviolet spectrogram of floate active ester

3.2 葉酸偶聯阿霉素白蛋白納米粒(FA-BSANPs/DOX)形態觀察

FA-BSANPs/DOX電鏡圖如圖2所示.

圖2 葉酸偶聯載阿霉素白蛋白納米粒的透射電鏡圖Fig.2 TEM image of FA-BSANPs/DOX

由圖2可見：FA-BSANPs/DOX呈球形，粒度較為均勻，分散性好.

3.3 FA-BSANPs/DOX粒徑分布、包封率及載藥量的測定

采用馬爾文粒度儀測定FA-BSANPs/DOX的粒徑大小，平均為(137.43±0.67) nm，90 %的粒徑小于139 nm，粒度分布較為均勻.采用柱前衍生化-高效液相色譜法測定其包封率為(89.43±0.67) %，載藥量高達(19.03±0.32)%.

3.4 體外釋放

FA-BSANPs/DOX累積釋放曲線如圖3所示.結果表明：0.5 h累積釋放百分率僅為(10.10±2.98) %，3 h內累積釋放(22.45±2.72) %，24 h 累積釋放(26.71±1.38) %，說明與DOX粉劑相比，FA-BSANPs/DOX釋放緩慢，并無明顯突釋現象.

圖3 阿霉素粉劑和葉酸偶聯載阿霉素白蛋白 納米粒的體外釋放曲線Fig.3 In vitro release of DOX and FA-BSANPs/ DOX microspheres

白蛋白納米粒(BSANPS)、阿霉素(DOX)和葉酸偶聯載阿霉素白蛋白納米粒(FA-BSANPs/BOX)對人肝癌細胞HEPG2、胃癌細胞SGC7901的相對活度如圖4、圖5所示.結果表明：白蛋白納米粒(BSANPs)對HEPG2和SGC7901基本無影響，葉酸偶聯載阿霉素白蛋白納米粒的相對活度低于阿霉素粉劑，FA-BSANPs/DOX和DOX對高表達的人肝癌細胞HEPG2細胞的IC50值分別為4.98 μmol/L和5.13 μmol/L，對人胃癌細胞SGC7901的IC50值分別為4.85 μmol/L和5.02 μmol/L，說明與粉劑相比FA-BSANPs/DOX的抗腫瘤活性略強[12-13].

圖4 白蛋白納米粒(BSANPs)、阿霉素(DOX)和葉酸 偶聯載阿霉素白蛋白納米粒FA-BSANPs/ DOX對人肝癌細胞HEPG2的相對活度Fig.4 The cell viability of BSANPs、 DOX and FA-BSANPs/DOX in HEPG2

圖5 白蛋白納米粒(BSANPs)、阿霉素(DOX)和葉酸 偶聯載阿霉素白蛋白納米粒(FA-BSANPs/ DOX)對人胃癌細胞SGC7901的相對活度Fig.5 The cell viability of BSANPs、 DOX and FA-BSANPs/DOX in SGC7901

4 結論與展望

以白蛋白為載體，利用葉酸酯結構中的羧基與白蛋白表面的活性氨基形成配位結合物的原理，簡單、方便地制備出高載藥量、高包封率的葉酸偶聯阿霉素白蛋白納米粒，載藥量高達19.03且藥物包封率較好.體外釋放研究表明所制備的FA-BSANPs/DOX顯著降低了DOX的釋放速度，具有緩釋性.體外藥效學實驗結果表明：與DOX粉劑相比，FA-BSANPs/DOX對HEPG2細胞和SGC7901細胞的抗腫瘤活性較強，其原因可能是通過配位作用將阿霉素與白蛋白螯合形成納米粒后，可以促進FA-BSANPs/DOX的細胞攝取；偶聯葉酸后，葉酸與腫瘤細胞表面葉酸受體有特異性親和，從而增加了其對腫瘤細胞的靶向性，抑制了HEPG2細胞和SGC7901細胞的生長，有助于抗腫瘤效果的提高.由此可見，葉酸偶聯載阿霉素白蛋白納米粒具有較高的應用價值,對FA-BSANPs/DOX的體內抗腫瘤效果以及毒性的研究是后期研究的重點內容.