單分子磁鑷測(cè)量Lambda DNA的拉伸曲線

林舒軒 王 碩 石赟琥 王文彥 房愛(ài)芳

(北京師范大學(xué)物理學(xué)系，北京 100875)

物理生物學(xué)是一個(gè)不斷發(fā)展的交叉領(lǐng)域。這個(gè)領(lǐng)域關(guān)注的核心內(nèi)容是定量的數(shù)據(jù)需要定量模型來(lái)分析，同時(shí)定量模型也需要為可被實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的現(xiàn)象做出預(yù)測(cè)[1]。一方面，物理建模可以用來(lái)理解定量的生物數(shù)據(jù)；另一方面，物理模型與生物實(shí)驗(yàn)之間可以相互促進(jìn)。近年來(lái)，單分子技術(shù)的快速發(fā)展大大推動(dòng)了物理生物學(xué)的發(fā)展。與傳統(tǒng)的生物實(shí)驗(yàn)是對(duì)于眾多分子活動(dòng)的集群平均不同，單分子技術(shù)關(guān)注的是單個(gè)分子的行為[2]。因此，單分子技術(shù)可以直接對(duì)生命活動(dòng)的中間態(tài)以及其分布進(jìn)行定量測(cè)量，提供動(dòng)力學(xué)過(guò)程的信息。而且單分子技術(shù)可以用來(lái)觀測(cè)分子結(jié)構(gòu)對(duì)于力學(xué)等操縱手段的響應(yīng)。

單分子操縱是一種新型的實(shí)驗(yàn)技術(shù)[3,4]，具體包括光鑷[5]、磁鑷[6]和原子力顯微鏡[7]等。近年來(lái)該技術(shù)發(fā)展迅速，科學(xué)家們借助該技術(shù)取得了豐富的成果，如MeCP2蛋白組裝的染色質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)[8]、人類端粒處多G-quadruplex(G4)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和折疊動(dòng)力學(xué)[8]、大腸桿菌單鏈結(jié)合蛋白的結(jié)合性質(zhì)[9]等方面的研究。磁鑷是單分子操縱技術(shù)的一種，它是通過(guò)外加磁場(chǎng)操縱磁性微粒，從而操縱與磁性微粒連接的生物大分子，研究單個(gè)分子的力學(xué)性質(zhì)，具有作用力強(qiáng)，操作方便，對(duì)生物大分子無(wú)損傷等優(yōu)點(diǎn)。一套完整的磁鑷裝置主要包括外磁場(chǎng)、顯微設(shè)備和數(shù)據(jù)采集處理設(shè)備。相比其他的單分子操縱技術(shù)，磁鑷可以施加大小合適的恒力，可以定量改變生物大分子的形變。因此，單分子磁鑷技術(shù)應(yīng)用非常廣泛。

目前我國(guó)本科階段的物理教學(xué)對(duì)于物理生物學(xué)的涉及并不多，物理實(shí)驗(yàn)教學(xué)在這方面尤為欠缺。基于此現(xiàn)狀，筆者經(jīng)過(guò)總結(jié)和思考，對(duì)一個(gè)操作難度適中的磁鑷實(shí)驗(yàn)——“單分子磁鑷測(cè)量Lambda DNA的拉伸曲線”進(jìn)行了有益的討論，力求通過(guò)本文為高校開展單分子磁鑷實(shí)驗(yàn)提供參考，使本科生初步接觸物理生物學(xué)，了解如何用物理思想解決生物學(xué)問(wèn)題；使本科生接觸先進(jìn)的單分子磁鑷技術(shù)，體驗(yàn)從樣品池修飾、連接反應(yīng)底物、顯微鏡觀察到數(shù)據(jù)采集及處理的完整實(shí)驗(yàn)過(guò)程，彌補(bǔ)物理生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)方面的欠缺。

1 實(shí)驗(yàn)原理

本實(shí)驗(yàn)是基于DNA分子具有一定的彈性[10,11]。DNA分子一般為雙鏈結(jié)構(gòu)，每條鏈由磷酸、脫氧核糖和堿基組成。每條鏈相鄰堿基間的堆積力和磷酸負(fù)電性導(dǎo)致的相鄰磷酸之間的排斥力使DNA趨向于形成直桿；另一方面，在DNA所處的環(huán)境中存在kBT(kB為玻爾茲曼常數(shù)，T為熱力學(xué)溫度)級(jí)別的熱擾動(dòng)，這種熱擾動(dòng)使DNA傾向于彎曲成團(tuán)狀。由此可見(jiàn)DNA分子具有一定的彈性。如果用外力去拉DNA分子，將會(huì)使其更趨向于形成直桿，兩端長(zhǎng)度會(huì)增加。對(duì)于DNA這類長(zhǎng)聚合物，通常用持久長(zhǎng)度A對(duì)其剛度進(jìn)行量化，長(zhǎng)度小于該力學(xué)量的長(zhǎng)聚合物可視為彈性棒，而長(zhǎng)度大于該力學(xué)量的聚合物則傾向于三維隨機(jī)游動(dòng)。在DNA所處的溶液環(huán)境和溫度一定時(shí)A為一常數(shù)；而沿著DNA輪廓的長(zhǎng)度為DNA輪廓長(zhǎng)度，記作L0，對(duì)于一種確定的DNA，L0為常數(shù)；將DNA兩個(gè)端點(diǎn)之間的距離命名為首末端距，記作L。當(dāng)施加的外力F不同時(shí)，L會(huì)隨之變化。

本實(shí)驗(yàn)主要利用抗原-抗體相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)DNA的固定。采用外徑為1mm的方形毛細(xì)管作為樣品池，對(duì)樣品池內(nèi)壁進(jìn)行清洗和硅烷化修飾(硅烷化修飾是用有機(jī)硅烷水溶液對(duì)樣品池內(nèi)壁進(jìn)行表面處理的過(guò)程，其作用是屏蔽外界活性基團(tuán)的影響)，并連接上地高辛抗體；在Lambda DNA兩端分別修飾有地高辛和生物素，這樣連接有地高辛的一端即可與樣品池內(nèi)壁相連并固定；向樣品池注入表面有生物素抗體的磁球，磁球?qū)?huì)連接到DNA修飾有生物素的一端,如圖1所示。磁球在磁鐵產(chǎn)生的磁場(chǎng)中受力，通過(guò)改變磁鐵與磁球間的距離，可以改變磁球的受力，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Lambda DNA的連續(xù)拉伸。

圖1 DNA兩端加力的方法

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)裝置

本實(shí)驗(yàn)的裝置主要包括樣品池、處理設(shè)備以及觀察裝置(帶橫向磁鑷的顯微鏡、CCD相機(jī)和搭載相關(guān)軟件的計(jì)算機(jī))。實(shí)驗(yàn)中所使用的磁鑷為一對(duì)永磁體，磁鑷方向沿水平方向(即橫向)，顯微鏡鏡頭方向(即垂直地面方向)為縱向(見(jiàn)圖2)。所使用的化學(xué)試劑及儀器清單見(jiàn)附錄1。

圖2 樣品池及磁鑷

2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.2.1 毛細(xì)管修飾與樣品池組裝

實(shí)驗(yàn)中利用丙酮和甲醇對(duì)毛細(xì)管壁進(jìn)行清洗，再利用濃硫酸過(guò)氧化氫混合液、APTS(3-氨丙基三乙氧基硅烷)及戊二醛對(duì)管壁進(jìn)行修飾，使其能夠連接上地高辛抗體(具體步驟見(jiàn)附錄2)。

2.2.2 組裝樣品架

將修飾完成的毛細(xì)管組裝到樣品架，取3～4cm軟管連接到出樣口和進(jìn)樣口，用凡士林密封。樣品架的結(jié)構(gòu)如圖3所示。

圖3 樣品架結(jié)構(gòu)

2.2.3 磁球-DNA-抗體-管壁連接

樣品池組裝完成后，向進(jìn)樣口注入稀釋后的地高辛抗體，并用鈍化液鈍化管壁。將Lambda DNA與磁球稀釋液注入離心管使其相連，待其充分連接后注入樣品池使Lambda DNA-磁球連接體與管壁上的地高辛抗體進(jìn)行連接，洗去游離磁球和DNA(具體步驟見(jiàn)附錄3)。本實(shí)驗(yàn)所用Lambda DNA為λ噬菌體的DNA，其結(jié)構(gòu)就是上文提到的經(jīng)典的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)。

2.2.4 觀察現(xiàn)象

得到處理完畢的樣品池后，打開計(jì)算機(jī)的Image J軟件，旋轉(zhuǎn)對(duì)焦旋鈕直至屏幕中出現(xiàn)磁球顆粒的圖像(如圖4)。輕輕擠壓軟管確定磁球的連接狀態(tài)，選取單根DNA連接的磁球。由于單根DNA的全長(zhǎng)近似16μm，磁球的直徑為2.8μm，單根連接的磁球擺動(dòng)的最遠(yuǎn)距離應(yīng)該約為35μm。如果磁球擺動(dòng)的最遠(yuǎn)距離明顯小于35μm，說(shuō)明有可能是多跟DNA連接的磁球，不是本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。用黑色標(biāo)志追蹤磁球位置(如圖4)。調(diào)節(jié)磁鑷逐漸靠近毛細(xì)管，觀察畫面中與DNA連接的磁球的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)變化。當(dāng)磁鑷距離毛細(xì)管較遠(yuǎn)時(shí)，能觀察到磁球具有明顯的熱漲落；當(dāng)磁鑷接近，磁球受力增大，磁球的熱漲落明顯減小。視野中部分磁球未觀察到漲落，說(shuō)明這些磁球固定于管壁。

圖4 磁球圖像(圖中黑色標(biāo)記代表對(duì)磁球的定位和追蹤)

2.2.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集

實(shí)驗(yàn)中利用Image J軟件追蹤磁球位置，通過(guò)改變磁鑷與毛細(xì)管的距離來(lái)改變對(duì)磁球施力的大小。首先將磁鑷置于較遠(yuǎn)的位置，由于磁球的布朗運(yùn)動(dòng)，其位置具有一定的漲落。用Image J獲得磁球在DNA伸展方向的位置y和垂直于DNA伸展方向的位置x，從而得到DNA首末端距L及x方向上的漲落。將磁鑷逐漸靠近毛細(xì)管，改變磁球的受力，同樣方法采集數(shù)據(jù)。最終得到不同受力情況下的磁球漲落數(shù)據(jù)。

3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及分析

生物大分子在不同的拉力范圍內(nèi)有不同的彈性性質(zhì)。對(duì)于DNA這種具有局部彎曲彈性的大分子，在0.1到幾十pN的拉力范圍內(nèi)，描述雙鏈DNA響應(yīng)拉伸力的最好模型是蠕蟲模型，即WLC模型[1]：

(1)

式中，kB是玻爾茲曼常量；T是熱力學(xué)溫度；A為DNA的持久長(zhǎng)度，在0.2mmol/L PB(磷酸鹽緩沖液)+140mmol/L NaCl溶液中，DNA的持久長(zhǎng)度A為50nm左右；L0是DNA的輪廓長(zhǎng)度，Lambda DNA的L0約為16.4μm；L是DNA的首末端距，為待測(cè)量；F是可控大小的外力，可根據(jù)DNA長(zhǎng)度及磁球布朗運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的位置漲落算出：

(2)

根據(jù)式(2)，我們可以由L和x方向上的漲落算出Lambda DNA受力，如表1。

表1 磁球橫向漲落、縱向位置及計(jì)算所得的L/L0和Lambda DNA受力大小

續(xù)表

根據(jù)式(1)擬合蠕蟲鏈模型的曲線，將實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)與蠕蟲模型進(jìn)行比對(duì)。如圖5：

圖5 Lambda DNA拉伸理論的蠕蟲鏈模型擬合

通過(guò)圖像我們可以看出，實(shí)驗(yàn)所得到的L/L0及其對(duì)應(yīng)的Lambda DNA受力大小之間的關(guān)系大致符合蠕蟲鏈模型。蠕蟲鏈模型同時(shí)考慮了鏈狀高分子的彎曲能和熵，體現(xiàn)了兩者之間的競(jìng)爭(zhēng)，兩者對(duì)總自由能的貢獻(xiàn)都很重要。當(dāng)DNA不斷被拉伸，分子可具有的構(gòu)型數(shù)目將會(huì)不斷地下降，因此熵隨之減少，發(fā)生熵形變。蠕蟲鏈模型從物理學(xué)角度形象地刻畫了DNA在熱擾動(dòng)作用下的彈性性質(zhì)。

4 實(shí)驗(yàn)的限制及改進(jìn)措施

本實(shí)驗(yàn)的限制主要有以下幾個(gè)方面：首先，攝像機(jī)及實(shí)驗(yàn)材料限制了測(cè)量的時(shí)間分辨率和空間分辨率；其次，該實(shí)驗(yàn)只能操縱一條Lambda DNA鏈，實(shí)驗(yàn)效率較低；第三，實(shí)驗(yàn)中通過(guò)對(duì)磁球施加扭矩的方法使Lambda DNA發(fā)生扭轉(zhuǎn)，施加到DNA上的扭矩遠(yuǎn)小于施加到磁球的扭矩，若要研究DNA的扭曲，其勢(shì)必會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。

針對(duì)以上這些限制，有如下改進(jìn)措施。

第一，磁球具有固有熱漲落，僅考慮熱漲落的影響，可檢測(cè)到的磁球最小變化距離有如下形式[12]

(3)

圖6 DNA鏈?zhǔn)芰εc分辨率的關(guān)系曲線[12](lc為DNA輪廓長(zhǎng)度；Beq為等效噪聲帶寬)

圖中分辨率由可分辨的最小尺寸表示，原式中常數(shù)κtether是基于雙鏈DNA蠕蟲鏈力響應(yīng)模型計(jì)算得到的。從圖中可以看出，分辨率隨著受力的增大和DNA長(zhǎng)度的減小而增大。當(dāng)Beq=100Hz，DNA鏈長(zhǎng)為1μm，受力大于3pN時(shí)，能夠獲得亞納米級(jí)的分辨率。

攝像機(jī)可檢測(cè)到的磁球最小變化距離有如下表達(dá)形式[12]

(4)

式中，Npixel為像素點(diǎn)的個(gè)數(shù)；fr為攝像機(jī)的采樣率。因此，我們可以通過(guò)增加像素點(diǎn)的個(gè)數(shù)和攝像機(jī)的采樣率來(lái)提高分辨率。目前攝像機(jī)和計(jì)算機(jī)的相關(guān)發(fā)展已經(jīng)能夠有效減輕由攝像機(jī)的位置追蹤引起的局限性，有效提高實(shí)驗(yàn)分辨率。

第二，磁鑷與其他的分子操縱技術(shù)不同，磁球受力方向的特殊性使其適合于平行測(cè)量。目前，基于磁鑷的千分子操縱技術(shù)得以開發(fā)并用于研究酶對(duì)DNA的裂解活性[13]等方面的研究，有效提高了實(shí)驗(yàn)效率。

第三，由于磁鑷的不對(duì)稱磁場(chǎng)產(chǎn)生的大扭矩，用磁鑷直接測(cè)量DNA分子的扭矩十分困難。針對(duì)這種情況，主流的設(shè)想是將該扭矩降低到DNA分子鏈內(nèi)部?jī)?chǔ)存的扭矩的水平，相關(guān)的工作還在開展中。例如，Gore等人利用非磁性小球?qū)εまD(zhuǎn)進(jìn)行靈敏測(cè)量,對(duì)DNA分子在拉伸狀態(tài)下的扭曲程度進(jìn)行研究，并發(fā)現(xiàn)DNA分子受力超過(guò)30pN時(shí)其扭轉(zhuǎn)-拉伸耦合取負(fù)值。[14]

此外，還可以通過(guò)將磁鑷與光鑷，結(jié)合實(shí)現(xiàn)對(duì)磁球的三維操縱；通過(guò)將磁鑷與熒光顯微技術(shù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合位置的觀測(cè)。

5 實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)

目前，部分高校在本科階段開設(shè)有物理生物學(xué)相關(guān)課程，但缺少相關(guān)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)。而本實(shí)驗(yàn)基于目前物理生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛的單分子操縱技術(shù)，其操作難度較低，成功率較高，無(wú)特殊的環(huán)境條件要求。因此適合在本科階段開設(shè)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，作為物理生物學(xué)課程的實(shí)驗(yàn)補(bǔ)充。

在該實(shí)驗(yàn)中，樣品池的修飾階段涉及濃硫酸等危險(xiǎn)化學(xué)品的使用，因此學(xué)生應(yīng)有老師陪同完成該階段的步驟。如果有條件能讓學(xué)生體驗(yàn)完整的生物物理實(shí)驗(yàn)，可安排連續(xù)的兩天(第一天8～9h，第二天2～3h)或三天(第一天4～5h，后兩天2～3h)時(shí)間；如果缺少條件，實(shí)驗(yàn)員可提前完成樣品池的修飾，這樣學(xué)生可以完成剩余步驟，所需時(shí)間約為2～3h。

6 結(jié)語(yǔ)

本文基于“單分子磁鑷測(cè)量Lambda DNA的拉伸曲線”實(shí)驗(yàn)介紹了物理模型在生物學(xué)問(wèn)題中的應(yīng)用。根據(jù)本科物理實(shí)驗(yàn)教學(xué)的現(xiàn)狀，詳細(xì)介紹了如何為本科生開展操作難度適中的物理生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。希望通過(guò)本文可以為其他高校提供參考經(jīng)驗(yàn)，豐富教學(xué)課程設(shè)計(jì)。

附錄1 實(shí)驗(yàn)儀器、材料

分析純丙酮，分析純甲醇，體積濃度30%過(guò)氧化氫溶液，98%濃硫酸，色譜級(jí)APTS(3-氨丙基三乙氧基硅烷)，分析純戊二醛，地高辛抗體(Anti-dig)，鈍化液(含PB，疊氮化鈉，Pluronic)，PBS緩沖液，凡士林，去離子水，濃度為100pmol/ L的Lambda DNA，磁球(μm級(jí))原液；

染色缸，燒杯，毛細(xì)管，三支大型滴管，標(biāo)簽紙，樣品架，墊圈，兩種不同規(guī)格的移液槍，移液槍槍頭，醫(yī)用針頭及針管，錐形瓶，量筒，鐵鉗，醫(yī)用膠帶，乳膠手套，離心管，離心管架；

超聲清洗儀，渦旋振蕩器，顯微鏡及工業(yè)相機(jī)，水浴鍋，CCD，搭載Image J軟件的計(jì)算機(jī)。

附錄2 毛細(xì)管修飾具體步驟

將毛細(xì)管置入染色缸，使用分析純丙酮注入浸泡清洗30分鐘，再取出毛細(xì)管，重新置于干凈的染色缸，用甲醇超聲清洗儀超聲清洗毛細(xì)管30分鐘；

將體積濃度30%過(guò)氧化氫溶液與濃硫酸3∶7混合，倒入新的染色缸，再將處理過(guò)的毛細(xì)管放入，放入水浴鍋水浴，達(dá)到95攝氏度后水浴浸泡2h；

取出后用去離子水洗干凈，徹底洗凈并烘干后用APTS與甲醇(1∶50)混合液浸泡處理毛細(xì)管2小時(shí)(此步驟不可有水)；洗凈后用戊二醛與水(1∶50)混合液過(guò)夜修飾，修飾完成后洗凈。(均使用去離子水清洗)

此步驟全過(guò)程需在通風(fēng)櫥內(nèi)完成。

附錄3 磁球-磁球-DNA-抗體-管壁連接具體步驟

將20μL地高辛抗體用PBS緩沖液稀釋至200μL，灌入樣品池，在室溫孵育40min，向樣品池中灌入100μL鈍化液，室溫孵育20min；

使用渦旋振蕩器充分振蕩均勻磁球原液，取6μL置入200μL離心管，利用磁鐵沉淀磁球并吸取上清液丟棄，再加入100μL PBS洗滌，反復(fù)三次，最終加入2μL PBS重懸；接著加入3μL濃度為100pmol/L的Lambda DNA，并輕彈管底使其混合均勻，然后在室溫條件下使其充分連接20min，期間不時(shí)搖晃離心管，防止磁球沉淀；混合完成后加入100μL PBS稀釋，然后將混合液輕輕灌入毛細(xì)管，向左立起樣品架并等待約30min，以便DNA連接至毛細(xì)管左邊側(cè)壁；最后緩緩?fù)ㄟ^(guò)軟管灌入100μL PBS，并以500μL/min的速度沖洗掉游離磁球和DNA。