蒸汽爆破預(yù)處理對紫甘薯花色苷抗氧化性及抑菌性的影響

易軍鵬，楊亞皇，李 欣，趙鵬成，賀 健

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽 471023；2.河南科技大學(xué)化工與制藥學(xué)院，河南洛陽 471023）

紫甘薯（Solanum tuberdsm） 又被稱為紫薯，屬于旋花科甘薯屬蔓生草本植物[1]，在我國廣東、河北等地均有種植[2]。紫甘薯含有多糖及花青素等多種功能性成分，研究表明，紫甘薯包含的活性成分具有較強(qiáng)的抗氧化性[3-4]、抗突變[5]、保護(hù)肝臟[6]、降血糖和抗腫瘤[7]等藥理作用。目前，與國外發(fā)達(dá)國家的研究相比，國內(nèi)對于紫甘薯花色苷的研究仍處于初級階段，尤其是對于花色苷的生物合成調(diào)控機(jī)理及關(guān)鍵基因的表達(dá)分析，這2個方面需要更加深入的研究[8]，而這對于如何高效應(yīng)用紫甘薯花色苷有十分重要的意義。

隨著生活觀念的轉(zhuǎn)變，人們對添加劑的安全性越來越重視，這就造成了從人工到天然的新革命?；ㄉ詹粌H能夠用作保健品添加劑，還能夠用作醫(yī)藥添加劑，并且也可以作為天然染色劑，而且將花色苷應(yīng)用到這些方面，很符合現(xiàn)代人的要求。有一些國家已經(jīng)成功將花色苷類的色素制成食品與藥品，由此可見，花色苷擁有巨大的開發(fā)潛力[9]。國內(nèi)外研究表明，蒸汽爆破（Steam explosion pretreatment，SEP）可有效提高原料溶出率、增加提取率。此外，蒸汽爆破作用會產(chǎn)生巨大的機(jī)械剪切力，能夠斷裂某些化學(xué)鍵，使物質(zhì)分子量減小、生物活性提高[10]。

試驗以未處理及不同蒸汽爆破條件預(yù)處理紫甘薯提取的花色苷為研究對象，通過紫外光譜掃描及高效液相色譜，研究蒸汽爆破對紫甘薯花色苷最大吸收波長和花色苷各組分相對含量的影響，以DPPH自由基、羥自由基和還原力為指標(biāo)研究蒸汽爆破對紫甘薯花色苷外抗氧化能力的影響。通過牛津杯法與二倍稀釋法，研究紫甘薯花色苷對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和沙門氏菌的抑菌性并測定最小抑菌濃度。為今后研究開發(fā)利用紫甘薯提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮紫甘薯，購自河南洛陽當(dāng)?shù)爻?，?jīng)鑒定品種為“寧紫4號”；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH），上海伊卡生物公司提供；無水乙醇、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、抗壞血酸、水楊酸、鹽酸、乙酸乙酯、檸檬酸、磷酸氫二鈉、乙腈、氫氧化鈉、AB-8型大孔樹脂，國產(chǎn)分析純，天津德恩化學(xué)試劑廠提供。

1.2 儀器與設(shè)備

QBS-80型間歇式蒸汽爆破機(jī)，正道啟寶環(huán)保科技有限公司產(chǎn)品；UV-4800型紫外可分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司產(chǎn)品；HH-S6型數(shù)顯恒溫電子水浴鍋，江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；SW-CJ-1G型超凈工作臺，江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司產(chǎn)品；LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 紫甘薯蒸汽爆破預(yù)處理

將紫甘薯清洗干凈，切丁，置于45℃烘箱內(nèi)干燥24 h，將干燥的紫甘薯用不同比例的去離子浸泡12 h，選取不同的爆破條件，在QBS-80型蒸汽爆破機(jī)中對原料進(jìn)行預(yù)處理。收集爆破后的原料，置于45℃烘箱內(nèi)干燥至恒質(zhì)量，干燥避光保存[11]。不同蒸汽爆破條件處理的紫甘薯提取的花色苷（SEP-1，SEP-2及SEP-3為同一維壓時間（45 s） 及含水率（10%），不同蒸汽爆破壓強(qiáng)（SEP-1，SEP-2及SEP-3處理條件分別為0.5，1.5，2.5 MPa） 處理條件下提取的紫甘薯花色苷。另取一部分未經(jīng)蒸汽爆破處理的干燥紫甘薯提取的花色苷（Untreated）作為對照。

1.3.2 紫甘薯花色苷提取工藝

參照李春陽等人[12]報道的方法并稍作修改，稱量紫甘薯粉末10.0 g放入三口燒瓶中，按料液比1∶35，pH值1.0，提取溫度60℃，提取時間1 h。反應(yīng)混合物在4℃下，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心10 min，上清液旋蒸得到紫甘薯花色苷粗提濃縮物。

1.3.3 紫甘薯花色苷純化工藝

（1）大孔樹脂預(yù)處理。大孔樹脂用無水乙醇浸泡24 h，用保鮮膜封好，去離子水沖洗抽濾一直到?jīng)]有醇味，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的氫氧化鈉浸泡24 h，用去離子水沖洗至中性，最后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的鹽酸溶液浸泡24 h，用去離子水沖洗抽濾至中性，將處理好的大孔樹脂放在45℃的烘箱中烘干。

（2）花色苷粗提物純化。在提取的花色苷粗提物中加入預(yù)處理好的AB-8型大孔樹脂，用檸檬酸和磷酸氫二鈉配制的pH值3的緩沖溶液溶解，用錫紙包裹，避光靜置48 h后進(jìn)行吸附。將吸附后的樹脂進(jìn)行濕法裝柱，用去離子水沖洗柱子，洗去柱子中含有的多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，一直到洗至無色。再用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇沖洗玻璃柱并收集洗脫液，直到洗脫液變成無色后結(jié)束動態(tài)脫附試驗。用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，在40℃，轉(zhuǎn)速100 r/min條件下旋蒸，除去乙醇和大部分的水，將純化后的紫甘薯花色苷于4℃條件下避光保存。

1.3.4 紫甘薯花色苷相對組分測定

（1）最大吸收波長的確定。把紫甘薯花色苷提取液在紫外-可見分光光度計上進(jìn)行200～800 nm波段的全波長掃描，并用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇（pH值1）作空白對照[13]。

（2）紫甘薯花色苷高效液相色譜分析。用去離子水將純化后的紫甘薯花色苷的濃縮物溶解，進(jìn)行高效液相色譜分析。色譜條件：AgilentZOBAXSBAQ型色譜柱（4.6 mm×250 mm×5μm），柱溫30℃，UV/VisDetector 2489型，檢測波長520 nm，進(jìn)液量10μL。所用的洗脫液為0.5%甲酸-水（A） 和乙腈（B），流速1 mL/min，梯度洗脫。

洗脫梯度見表1。

表1 洗脫梯度

1.3.5 蒸汽爆破對紫甘薯花色苷抗氧化性影響

（1） DPPH自由基清除率的測定。參考朱璐等人[14]的方法并做適當(dāng)修改：配制不同濃度的花色苷溶液，試管中加入2 mL不同濃度的花色苷樣液和濃度0.1 mmol/L DPPH·乙醇溶液2 mL（現(xiàn)配現(xiàn)用），混勻后于常溫下避光靜置30 min，快速在波長517 nm處測定吸光度A1，用等體積無水乙醇代替DPPH乙醇溶液測定吸光度為A2，用等體積蒸餾水代替樣液測定吸光度為A0。自由基清除能力計算公式如下：

（2）·OH清除率的測定。參考Smironff N等人[15]報道的方法做適當(dāng)修改：配制不同濃度的花色苷溶液，向試管中依次加入1 mL不同濃度的花色苷樣液、10 mmol/LFeSO4溶液1 mL和10 mmol/L水楊酸乙醇溶液1 mL。加入8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL啟動反應(yīng)，于37℃水浴條件下反應(yīng)30 min，迅速在波長510 nm處測定吸光度A1，用無水乙醇代替水楊酸乙醇溶液測定吸光度A2，用體積分?jǐn)?shù)40%乙醇代替樣液測定吸光度A0。自由基清除能力計算公式如下：

（3）還原力測定。參考Ak T等人[16]報道的方法并做適當(dāng)修改，配置不同濃度的花色苷溶液，取2 mL樣液分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鐵氰化鉀溶液2 mL，于50℃水浴鍋中加熱20 min，使其充分反應(yīng)，流水迅速冷卻并加入10%三氯乙酸溶液（W/V） 2 mL，混勻后離心，取2 mL混合液，加入蒸餾水1.6 mL及質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%FeCl3溶液0.4 mL，混勻后靜置30 min，于波長700 nm處測定吸光度Ai。

1.3.6 蒸汽爆破對紫甘薯花色苷抑菌特性影響

（1） 菌種活化和標(biāo)準(zhǔn)菌懸液制備。挑取1～2環(huán)供試菌種接入試管斜面培養(yǎng)基上，于37℃下培養(yǎng)16～24 h后，用無菌生理鹽水洗下菌苔，制成菌懸液。采用麥?zhǔn)媳葷岱ǎ脽o菌生理鹽水調(diào)節(jié)細(xì)菌含量為1×108CFU/mL。

將復(fù)蘇好的供試菌菌懸液按體積比1∶50接種于新鮮細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，于37℃下，以轉(zhuǎn)速220 r/min培養(yǎng)20 h后，于4℃下以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心10 min，沉淀物用無菌生理鹽水洗滌2次，每次10 mL，然后用無菌生理鹽水調(diào)整菌懸液濃度為OD600=0.1（約0.5麥?zhǔn)蠁挝唬?×108CFU/mL），得到標(biāo)準(zhǔn)菌懸液。

（2）牛津杯法抑菌試驗。根據(jù)陳希文等人[17]報道的方法并稍作修改，將活化的供試菌種接種于已融化并降溫至55℃左右的固體培養(yǎng)基中，接種量1%，混合均勻，倒入滅菌培養(yǎng)皿中，凝固后，用無菌鑷子將牛津杯放培養(yǎng)皿中。然后將配好的紫甘薯花色苷加入牛津杯中，同時以甲醇作空白對照，加完后，于37℃下靜置于恒溫培養(yǎng)箱中24 h。

（3）紫甘薯花色苷最小抑菌質(zhì)量濃度（MIC） 測定。二倍稀釋法：參照賈培培[18]報道的方法稍作改動，取8支試管分別加入5 mL液體培養(yǎng)基（其中第1支試管加9.5 mL），加入0.5 mL樣液于第1支試管中，混勻后取出5 mL并加入第2管中，然后依次取出5 mL移入下一管，到第8管時棄去5 mL，再在這7管中分別加入0.1 mL培養(yǎng)好的菌液。另取2支試管分別編號為9和10，其中第9號試管作為空白對照，只加5 mL液體培養(yǎng)基，不加藥液；第10號試管作為空白對照，加5 mL液體培養(yǎng)基和溶劑甲醇。用二倍遞減稀釋法將紫甘薯花色苷配制成質(zhì)量濃度分別為 2，1，0.5， 0.25，0.125，0.062 5，0.031 25，0.015 625 mg/mL的花色苷溶液，于37℃下恒溫培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)基中完全沒有菌生長（透明） 的最低濃度作為提取物的MIC，對爆破后樣品選取SEP-2進(jìn)行試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫甘薯花色苷相對組分測定

2.1.1 最大吸收波長測定

未爆破紫甘薯花色苷全波長掃描圖見圖1，蒸汽爆破后紫甘薯花色苷全波長掃描圖見圖2。

圖1 未爆破紫甘薯花色苷全波長掃描圖

圖2 蒸汽爆破后紫甘薯花色苷全波長掃描圖

圖1 和圖2分別為未爆破處理和蒸汽爆破處理后的紫甘薯提取得到的花色苷溶液的全波長掃描圖譜。爆破后的紫甘薯花色苷的最大吸收度為527 nm，而未爆破處理的紫甘薯花色苷的最大吸收度為531 nm。這2個值均屬于花色苷的可見光區(qū)特征吸收峰的位置，因此，可以推斷提取物為紫甘薯花色苷。而這2種花色苷溶液最大吸收度的差異，可能是蒸汽爆破導(dǎo)致花色苷結(jié)構(gòu)微弱變化引起的。

2.1.2 紫甘薯花色苷高效液相色譜分析

未爆破、爆破后和樣品花色苷的高效液相色譜圖見圖3，不同爆破條件下花色苷的高效液相色譜圖見圖4，未爆破和蒸汽爆破處理花色苷不同峰位置的相對面積見表2，不同蒸汽爆破條件下花色苷不同峰位的相對面積見表3。

圖3 未爆破、爆破后和樣品花色苷的高效液相色譜圖

圖4 不同爆破條件下花色苷的高效液相色譜圖

表2 未爆破和蒸汽爆破處理花色苷不同峰位置的相對面積/%

表3 不同蒸汽爆破條件下花色苷不同峰位的相對面積/%

由圖3可以看出，提取得到的爆破前和爆破后的紫薯花色苷與購買的花色苷，色譜圖上峰的個數(shù)、峰的位置和出峰的時間都幾乎相同，說明溶劑提取法提取所得均為花色苷。但是各個峰的面積卻不一樣，由此可以說明各個花色苷的相對含量不一樣。由表2可知，紫甘薯花色苷爆破前后在1，2，4，6處峰的相對百分含量有所減少，而3，5，7處峰的相對百分含量有所增加；峰相對含量的減少可能是蒸汽爆破下，1，2，4，6的花色苷結(jié)構(gòu)發(fā)生了轉(zhuǎn)變，轉(zhuǎn)變?yōu)?，5，7這3種花色苷。由圖4和表3可以看出，在爆破時如果維持相同的爆破時間，爆破壓力越大，所對應(yīng)花色苷的相對含量有所減少，說明在高爆破強(qiáng)度下花色苷可能分解；在維持爆破時間45 s時，1，3，4處峰的相對百分含量減少，2，5，6，7處峰的相對百分含量增加了，說明不同位置的花色苷由于蒸汽爆破發(fā)生了結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。而且爆破強(qiáng)度越小、維壓時間越短，所對應(yīng)的花色苷的相對含量則越多。

2.2 蒸汽爆破預(yù)處理對紫甘薯花色苷抗氧化性的影響

2.2.1 蒸汽爆破處理對紫甘薯花色苷DPPH·清除率的影響

紫甘薯花色苷的抗氧化活性：DPPH·的清除作用見圖5。

圖5 紫甘薯花色苷的抗氧化活性：DPPH·的清除作用

DPPH乙醇溶液在517 nm處有最大吸收峰，抗氧化劑的加入能夠使DPPH·消失，顏色變淺，因此常用分光光度計進(jìn)行定量分析。由圖5可知，紫甘薯花色苷擁有較強(qiáng)的DPPH·清除能力，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.2 mg/mL時，Untreated，SEP-1，SEP-2，SEP-3清除率分別為91.75%，93.14%，95.74%，91.37%。由圖5可知，蒸汽爆破預(yù)處理后，對于紫甘薯花色苷DPPH·清除能力有一定的提高，其中SEP-2比未處理樣品清除率提高了約4%，蒸汽爆破預(yù)處理后紫甘薯花色苷抗氧化性提高推測原因如下：一方面由于花色苷組分相對含量發(fā)生變化；另一方面蒸汽爆破會導(dǎo)致一些糖苷鍵的斷裂，使得花色苷分子結(jié)構(gòu)中的活性基團(tuán)（酚羥基）暴露出來，從而使抗氧化性增強(qiáng)。

2.2.2 蒸汽爆破處理對紫甘薯花色苷·OH清除率的影響

紫甘薯花色苷的抗氧化活性：·OH的清除作用見圖6。

有關(guān)研究表明，·OH與大多數(shù)的腫瘤、癌癥及衰老有關(guān)，而紫甘薯花色苷能夠提供氫離子，可以把機(jī)體內(nèi)有害自由基還原成穩(wěn)定的化合物。由圖6可知，當(dāng)紫甘薯花色苷質(zhì)量濃度為0.006 25～0.05 mg/mL時，其羥自由基清除能力與質(zhì)量濃度成正相關(guān)，當(dāng)質(zhì)量濃度超過0.1 mg/mL時，質(zhì)量濃度對羥自由基清除能力影響不大。未蒸汽爆破處理提取的紫甘薯花色苷清除率最高可達(dá)82.74%，蒸汽爆破處理后SEP-2質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時，·OH清除率達(dá)到85.37%。

圖6 紫甘薯花色苷的抗氧化活性：·OH的清除作用

2.2.3 蒸汽爆破處理對紫甘薯花色苷還原力的影響

紫甘薯花色苷的抗氧化活性：還原力見圖7。

圖7 紫甘薯花色苷的抗氧化活性：還原力

研究表明，鐵氰化鉀測定抗氧化性，吸光度越大，物質(zhì)的抗氧化能力越強(qiáng)。由圖7可知，紫甘薯花色苷具有一定的鐵離子還原力，蒸汽爆破處理后，SEP-3樣品在相同質(zhì)量濃度情況下還原力均低于未經(jīng)蒸汽爆破處理的樣品，但SEP-1及SEP-2鐵離子還原力要稍強(qiáng)于未經(jīng)蒸汽爆破處理的樣品。

2.3 蒸汽爆破處理對紫甘薯花色苷抑菌特性的影響

2.3.1 紫甘薯花色苷抑菌活性

紫甘薯花色苷對菌種抑菌活性見表4。

表4 紫甘薯花色苷對菌種抑菌活性

由表4可知，紫甘薯多色苷對于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和沙門氏菌均具有較強(qiáng)的抑制作用，但蒸汽爆破處理后，紫甘薯花色苷對于各菌種的抑菌圈直徑均有不同程度的降低，推測其原因為，在蒸汽爆破過程中，高溫使花色苷的抑菌性降低，但由于蒸汽爆破過程時間十分短暫，因此影響不大。

2.3.2 紫甘薯花色苷最小抑菌濃度（MIC）測定

未處理紫甘薯花色苷最小抑菌質(zhì)量濃度（MIC）的測定結(jié)果見表5，蒸汽爆破預(yù)處理紫甘薯花色苷最小抑菌質(zhì)量濃度（MIC）的測定結(jié)果見表6。

由表5和表6可知，紫甘薯多色苷對于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和沙門氏菌最小抑菌質(zhì)量濃度（MIC） 分別為0.125，0.25，0.25，0.062 5 mg/mL，蒸汽爆破預(yù)處理對紫甘薯花色苷的最小抑菌質(zhì)量濃度無顯著影響。

表5 未處理紫甘薯花色苷最小抑菌質(zhì)量濃度（MIC）的測定結(jié)果

表6 蒸汽爆破預(yù)處理紫甘薯花色苷最小抑菌質(zhì)量濃度（MIC）的測定結(jié)果

3 結(jié)論

將紫甘薯進(jìn)行蒸汽爆破預(yù)處理，采用溶劑提取法制備紫甘薯花色苷并采用大孔樹脂進(jìn)行純化，全波長掃描結(jié)果表明，蒸汽爆破處理后紫甘薯花色苷的最大吸收波長由531 nm變?yōu)?27 nm。高效液相色譜檢測結(jié)果表明，對爆破和未爆破處理的紫甘薯提取所得的均為花色苷，但各組分的相對含量不同。紫甘薯花色苷的體外抗氧化試驗結(jié)果表明，一定范圍內(nèi)花色苷的抗氧化性與質(zhì)量濃度呈正比。蒸汽爆破預(yù)處理后，紫甘薯花色苷的DPPH自由基清除能力和羥自由基清除能力有一定的提升，而還原力基本不變。采用牛津杯法檢測紫甘薯花色苷的抑菌性，結(jié)果表明紫甘薯花色苷對于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和沙門氏菌均具有較強(qiáng)的抑制作用，其最小抑菌質(zhì)量濃度（MIC） 分別為0.125，0.25，0.25，0.062 5 mg/mL。試驗對未處理及蒸汽爆破預(yù)處理的紫甘薯花色苷進(jìn)行組分測定，并對其抗氧化性及抑菌特性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，蒸汽爆破預(yù)處理并未破壞花色苷結(jié)構(gòu)，在維持原有抑菌性的基礎(chǔ)上在一定程度上提高了花色苷的抗氧化能力，這對今后紫甘薯綜合資源的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。