3個耐鹽內生菌對提高杜梨耐鹽能力的影響

談峰，王瑩，郭聰，李玉娟

(江蘇沿江地區農業科學研究所，江蘇 如皋 226541)

改良鹽堿地的最佳技術方案是通過綠化降鹽，而篩選耐鹽堿樹木是首選。高耐鹽植物非常稀少，而可用種植于中高鹽含量土壤的樹種則更少，所以，通過一定的技術手段提高中低耐鹽樹木的耐鹽能力是一個好的思路。自然界中生物對外界環境的適應性提高歷來有自身適應性提高和外力干擾性提高2種。在植物對不良生存環境的適應性提高中，依靠外力的作用提升是一種非常有效的技術手段，利用菌類與植物的共生關系提高植物在鹽堿條件下的生存能力也是一個研究方向。賀忠群等[1]對叢枝菌根真菌提高植物耐鹽性的機制進行了研究，認為菌根能促進植物對關鍵營養元素的吸收與利用，并減緩鹽離子對植物的毒害作用。自然界中能和植物形成共生關系的真菌不多，而形成共生且能促進植物提高耐鹽能力的真菌就更少了，而在細菌中卻有不少耐鹽甚至嗜鹽的種類。丁新景等[2]研究認為，阿氏芽孢桿菌等根際菌對雪蓮的生長具有促進作用，尤其對根系生長的促進作用明顯；井大煒等[3]的研究認為，在一定條件下接種蠟樣芽孢桿菌能改善堿蓬根際土壤的微環境，在輕度鹽脅迫的條件下效果更好。總體而言，在利用天然微生物菌體改良植物耐鹽能力方面，所做的研究還不多。杜梨是優秀的耐鹽堿樹種，但其不適合在含鹽量高于0.36%的中度鹽堿地種植。我們在研究植物耐鹽性的過程中，提取某些高耐鹽植物的內生耐鹽菌，放大培養后接種到無土基質中，再進行放大培養，用此培養基種植杜梨，觀察內生耐鹽菌對杜梨耐鹽能力的影響。

1 材料與方法

1.1 耐鹽菌的獲取和培養

在江蘇如東海灘淺水處取鹽生植物大米草(SpartinaanglicaHubb.)等，在實驗室分離植物內生菌并提純。

分離培養基配方：黃豆50 g，瓊脂12 g。黃豆先制備豆漿，然后用含鹽量10%的海水兌至1 L，加入瓊脂，溶解，滅菌后冷卻備用。

擴大培養基配方：牛肉浸膏20 g，精解蛋白胨15 g，馬鈴薯200 g，瓊脂13 g，加含鹽10%的海水至1 L，滅菌，冷卻，接種。

液體菌種配方：牛肉浸膏20 g，精解蛋白胨15 g，馬鈴薯2 500 g，黃豆粉15 g，加含鹽10%的海水至1 L。按常規液體菌種培養方式進行。

1.2 無土基質的配制

按體積比將木腐菌糠30%、秸稈20%、雙孢蘑菇菌糠50%均勻混合。所有菌糠料和秸稈料均腐熟發酵。按體積比20∶1混入耐鹽菌液體菌種，水分調節使用含鹽15%的海水，堆積培養10 d，備用。

1.3 杜梨種植

以28 cm×17 cm花盆為容器移栽杜梨，根部分帶少量心土和洗凈2種處理。每樣本50株，地徑1 cm，定高50 cm，全去葉，以含鹽4%的海水噴霧基質表面保持基質濕潤。記錄植株發芽與情況。生長穩定后，取樣測量根系萌發數量與生長長度，以根系萌發并健康生長為指標來確定杜梨成活。

1.4 菌株侵入檢測

取新生根分離，檢查是否有菌株進入植株。

2 結果與分析

2.1 耐鹽菌菌株

從鹽生植物大米草等體內分離獲得了3個耐鹽的菌株，命名為BR1、BR2、BR3。經鏡檢，這3個菌株均屬于細菌類。3個菌的菌株單體球形，被毛，菌落念珠狀，光滑。BR3菌株單菌鏡檢形態見圖1。3個菌株的皿培形態見圖2，BR1蛋黃色，BR2有油性，BR3乳白色。皿培培養接種20 h菌株開始萌動，48 h菌落成型；液體培養5 d菌液成熟，菌液有臭雞蛋味，液體表面有沬，中間可見混濁懸浮體。

圖1 BR3單菌的鏡檢

圖2 3個菌株的培養結果

2.2 基質

培養成熟的基質手握有黏稠感，稍有彈性，輕微腐臭味，這是耐鹽菌在基質中得到進一步生長并成熟的標志。耐鹽菌能在基質中存活并先行利用基質的材料是確保兩者能完美融合的基礎，適當的菌體數量是保證耐鹽菌優勢菌群的重要基礎，只有具備了適當的耐鹽菌群數量的基質，才有可能保證在植株栽植后，能夠得到有效的侵入與融合。

2.3 杜梨生長情況

杜梨在經過20 d的培養以后，對鹽堿的適應性開始出現差異，標志是新生葉的萎蔫和隨后的植株死亡。植物根系是維系植物生長的根本，葉片通過光合作用制造植物繼續生長的營養，保證植物生長持續。葉片死亡即代表植物失去了獲得新生力量的能力。

在植株栽入盆缽后8～10 d，所有植株均開始萌發新芽，并陸續發生新葉。但自21 d開始，陸續有植株的葉片開始萎蔫，最先發生萎蔫的是經BR1菌處理的，至36 d，杜梨所有葉片全枯死；BR2處理中的杜梨洗根苗全部萎蔫，帶心土杜梨苗葉片沒有萎蔫，但也沒有繼續生長；BR3處理的洗根和帶心土的杜梨苗葉片有生長的現象，標志為新芽頂部開始拉長。

杜梨植入盆體60 d，所有萎蔫植株沒有新葉發生，存活新葉的植株新枝明顯生長。BR2心土處理、BR3洗根與心土處理杜梨均有新根生長，所有己萎蔫的植株均無新根發生的痕跡。

3個菌株處理基質中BR2、BR3新根生長見圖3，表明不是所有的植物耐鹽內生菌都對其他植物有效，菌株的適應性篩選很重要。是否正常發生出新生根，是判斷植物移栽是否真正成活的主要指標。杜梨在含3個菌株的基質上生根表現差異較大：BR1沒有效果，BR2在移栽植株保留有原生土的情況下是能夠成活的，但沒有原生土則不能成活；而BR3無論是帶心土移栽，還是不帶心土移栽，均能很好地生根，帶心土的生根更好，根系也更發達。

圖3 BR2、BR3成活處理的杜梨根系生長

培養90 d，測量杜梨中新生根條數、根長，結果顯示，在正常生長新根的處理中，不同菌株對杜梨在高鹽基質中的生根數量、生根速度、新生根生長速度影響差異較大(表1)。在高鹽條件下，添加了BR3菌株的基質中盆栽杜梨生長較好，在以4%含鹽量的海水作為噴灌用水的條件下仍然能夠生長，添加BR2菌株的基質上杜梨能夠成活，添加BR1菌株的基質上杜梨無法存活。曾廣萍等[4]研究表明，AM真菌可以提高植物的耐鹽性。BR2、BR3均分離自非杜梨淺海水植物，含有該菌的基質可以促進杜梨在高鹽度環境存活并獲得生長。

表1 3個菌株的生根結果

2.4 新生根菌株分離

對杜梨新生根組織進行分離培養，在含BR2和BR3菌株的基質上長出的新生根中分離出了耐鹽細菌，經拮抗對比試驗確認為接入基質的同種菌，說明，此菌是通過基質進入杜梨組織，杜梨借由此菌之力，在高鹽基質中萌發新根，從而確保成活。

BR2、BR3均可從培養的杜梨植株新生根中分離到，結合杜梨在高鹽基質中的存活與生長情況，可以確定這2個菌株與杜梨形成了共生關系，從而為杜梨在高鹽基質中的生存提供了環境保證，張靜等[5]研究認為，硫氧化細菌可改良鹽堿土中的堿性，通過改善植物生長的pH環境來影響植物生長的條件。杜梨的耐鹽極限是0.30%，至0.36%則全死亡[6]。本研究證明，在添加了BR2、BR3的基質中移栽的杜梨，可以在鹽濃度4.00%的基質中存活并生長，管理過程以4.00%的海水作為生產管理用水不影響杜梨的生長。

3 小結

植物內生菌是指存活于健康植物組織內部，又不引發宿主植物表現出明顯感染癥狀的微生物類群，這可能是由于內生細菌生活在植物組織內部，與宿主植物形成了緊密的共生關系，引發的多種效應的綜合結果。本研究中2個菌株的效果良好，這是否與基質本身的高營養有關？而鹽堿實地的土壤營養含量很低，BR2、BR3菌株在實地移栽中的效果是否與盆栽一樣？一定范圍內添加這種基質是否能解決植物在鹽堿地中的移栽成活難題？還有待于進一步的研究。