微小RNA-543對大鼠骨關節炎軟骨細胞的作用機制研究

羅奮棋　林院　徐杰

【摘要】 目的：研究微小RNA-543對大鼠骨關節炎軟骨細胞存在的保護作用機制。方法：此次研究選取20只健康SD（Sprague-Dawley）大鼠進行研究，采取隨機數字表法將入組的大鼠分成研究組和對照組，每組10只，對照組大鼠不進行特殊處理，研究組大鼠接受關節內側副韌帶切斷術，構建建立大鼠骨關節炎（OA）模型，采用PCR檢測方法分別檢測兩組大鼠軟骨組織的microRNA-543表達水平。對大鼠正常膝關節軟骨細胞進行體外分離，10 ng/L的IL-1β培養24 h形成體外OA模擬狀態，使用miR-543 mimics進行轉染，觀察分析miR-543過表達對IL-1β誘導條件下軟骨細胞增殖及凋亡相關基因表達水平的影響。結果：研究組大鼠的軟骨組織中miR-543的表達水平顯著低于對照組（P<0.05）。miR-543 mimics轉染后軟骨細胞的增殖率明顯高于對照組（P<0.05），經過IL-1β誘導處理的軟骨細胞增殖能力顯著低于對照組（P<0.05），經過miR-543 mimics轉染后IL-1β誘導處理過的軟骨細胞增殖能力顯著上升（P<0.05）。miR-543 mimics轉染細胞MDM4 mRNA表達水平明顯低于對照組（P<0.05），Akt1和Bcl-2 mRNA的表達顯著高于對照組（P<0.05），經過IL-1β誘導處理后的軟骨細胞MDM4 mRNA表達顯著高于對照組（P<0.05），Akt1和Bcl-2 mRNA表達則顯著低于對照組（P<0.05），經過miR-543 mimics轉染后，IL-1β誘導處理過的軟骨細胞MDM4、Akt1和Bcl-2 mRNA表達水平的變化能夠得到顯著緩解（P<0.05）。結論：OA大鼠的軟骨組織miR-543表達會顯著下降，通過miR-543 mimics轉染促進miR-543表達上調，能夠使軟骨細胞的增殖得到提升，加之對MDM4、Akt1、Bcl-2表達的影響，能夠有效對抗IL-1β誘導引發的軟骨細胞損傷。

【關鍵詞】 微小RNA-543; 骨關節炎; 軟骨細胞; 作用機制; 細胞凋亡

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.24.001 文獻標識碼 A 文章編號 1674-6805（2019）24-000-03

【Abstract】 Objective：To study the protective mechanism of microRNA-543 on the presence of chondrocytes in rat osteoarthritis.Method：In this study，20 healthy SD（Sprague-Dawley） rats were randomly divided into study group（n=10） and control group（n=10）.The rats in the study group were treated without special treatment.The rats in the study group underwent medial collateral ligament cutting，and the model of osteoarthritis（OA） was established.The expression of microRNA-543 in cartilage tissue of the two groups was detected by PCR.Rat normal knee cartilage cells were isolated in vitro and cultured with 10 ng/L IL-1β for 24 h to form OA simulation in vitro.The effect of miR-543 overexpression on the proliferation of chondrocytes and the expression level of apoptosis-related genes under the induction of IL-1 under the induction of IL-1 was observed.Result：The expression level of miR-543 in cartilage tissue of the study group was significantly lower than that of the control group（P<0.05）.The proliferation rate of cartilage cells induced by miR-543 mimics was significantly higher than that of the control group（P<0.05）.The proliferation ability of cartilage cells induced by IL-1β was significantly lower than that of the control group（P<0.05）.The proliferation ability of treated cartilage cells induced by IL-1β was significantly increased after miR-543 mimics transfection（P<0.05）.The expression of MDM4 mRNA in miR-543 mimics transfected cells was significantly lower than that in the control group（P<0.05）.The expression of Akt1 and Bcl-2 mRNA was significantly higher than that of the control group（P<0.05）.The expression of MDM4 mRNA in chondrocytes induced by IL-1β was significantly higher than that in the control group（P<0.05），and the expression of Akt1 and Bcl-2 mRNA.The expression of MDM4，Akt1 and Bcl-2 mRNA in chondrocytes induced by IL-1β was significantly relieved after transfection with miR-543 mimics（P<0.05）.Conclusion：The expression of miR-543 in cartilage tissue of OA rats is significantly decreased.The expression of miR-543 is up-regulated by miR-543 mimics transfection，which can enhance the proliferation of chondrocytes and the expression of MDM4，Aktl and Bcl-2.The effect is effective against the chondrocyte damage induced by IL-1β.

【Key words】 MicroRNA-543; Osteoarthritis; Chondrocytes; Mechanism of action; Apoptosis

First-authors address：Fujian Medical University Provincial Clinical College，Fuzhou 350001，China

骨關節炎屬于關節邊緣處的退行性病變，其發生和發展與年齡、體重、外部創傷、勞損及先天性異常等因素，具有密切關系，是多樣因素引發的關節軟骨退化損傷、關節邊緣及軟骨下骨反應性增生[1-2]。骨關節炎在老年患者中具有較高的發病率，屬于常見的慢性疾病，患者會出現緩慢發展的關節疼痛、壓痛及僵硬、腫脹和活動受限等癥狀，對患者的生活質量會產生嚴重影響[3-4]。骨關節炎的發病機制較為復雜，研究分析認為軟骨細胞的異常遷移和增殖，引發關節軟骨的修復功能異常，可能是導致疾病發生的主要原因，也是臨床治療中最主要的靶標[5-6]。微小RNA作為內源性非編碼小RNA，能夠翻譯抑制或切割靶基因RNA，進而使蛋白質的表達水平下降，對細胞增殖與凋亡形成調控作用[7-8]。既往研究中對miR-543在骨肉瘤腫瘤細胞等方面的作用進行了分析，但對于其在骨關節炎中的作用機制尚未進行研究，相關作用機制尚不明確[9-11]。此次研究選取20只健康SD（Sprague-Dawley）大鼠進行研究，對比分析正常大鼠和關節炎大鼠的microRNA-543表達水平，并通過體外分離和IL-1β誘導，分析miR-543過表達對骨關節炎大鼠軟骨細胞增殖及凋亡相關基因及炎癥因子表達的影響，進一步研究和明確微小RNA-543對大鼠骨關節炎軟骨細胞的保護作用機制，報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

此次研究選取20只健康SD（Sprague-Dawley）大鼠（濟南金豐實驗動物有限公司）進行研究，入組后大鼠均使用常規飼料喂養，體重范圍是320～350 g，平均體重（328.46±5.26）g，采取隨機數字表法將入組的大鼠分成研究組和對照組，每組10只，對照組大鼠不進行特殊處理，研究組大鼠接受關節內側副韌帶切斷術，建立大鼠骨關節炎（OA）模型，使用0.5%的水合氯醛經腹腔注射麻醉，使用劑量為0.35 g/100 g。在完成手術，兩組大鼠均連續3 d肌肉注射青霉素，使用劑量是2×104 U/kg。在1周后，驅趕兩組大鼠進行跑步運動，30 mim/d。入組大鼠的選取和應用均符合美國國家衛生研究院實驗動物護理和使用指南要求。

1.2 實驗方法

軟骨細胞的原代培養和miR-543 mimics轉染方法：在無菌環境下，摘取正常大鼠的雙側膝關節軟骨，切下一部分組織進行RNA提取，剩余部分放到含雙抗的磷酸鹽緩沖液中進行清洗，300 g離心處理10 min后，去除上清，使用20%FBS DEME-F12培養液進行培養，溫度37 ℃，濕度適度，空氣環境5%CO2。在實施轉染的前1 d，以2×105/cm2的密度，把待轉染細胞接種到12孔板上，當細胞融合率達到60%～80%時，按照轉染試劑盒的說明要求實施miR-543 mimics轉染，并進行相應的陰性對照，在驗證轉染效率之后實施后續實驗步驟。

軟骨細胞增殖能力檢測方法：制取對數生長期的軟骨細胞，于96孔板中進行接種，每孔的接種細胞數量是5 000個，每組設置6個復孔，并設立無細胞空白對照組。在軟骨細胞miR-543 mimics轉染之后，10 ng/L的IL-1β培養24 h，每孔當中加入5 μg/ml的MTT溶液20 μl，在孵育4 h后，去除上清，每孔加200 μl的DMSO，振蕩處理10 min之后，使用酶標儀讀取光密度值，重復三次讀取。

細胞凋亡相關基因和炎癥因子的檢測方法：使用PCR方法檢測，在6孔板中培養原代軟骨細胞，miR-543 mimics不轉染和轉染48 h條件下，10 ng/L的IL-1β培養24 h，使用TRIzo1試劑盒提取細胞總RNA，再反轉錄合成cDNA之后實施PCR檢測，觀察基因表達水平，按照說明書要求操作。反應的條件是90 ℃環境下3 min。

1.3 統計學處理

使用SPSS 18.0統計軟件進行數據處理，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組別軟骨組織及細胞中的miR-543表達水平對比

研究發現，對照組大鼠和對照細胞的miR-543相對表達水平是1.00，研究組的表達水平是（0.62±0.16），經過IL-1β誘導處理組的水平是（0.74±0.17），研究組大鼠的軟骨組織中miR-543的表達水平顯著低于對照組（P=0.012），經過IL-1β誘導處理的軟骨細胞miR-543的表達水平顯著低于未進行誘導處理的軟骨細胞（P=0.024），見圖1。

2.2 miR-543表達水平上調對骨關節炎軟骨細胞增殖能力的影響

研究發現，對照組骨關節炎軟骨細胞相對存活情況是（1.00±0.18），經過IL-1β誘導處理組是（0.51±0.14），miR-543 mimics轉染組是（1.29±0.12），經過miR-543 mimics轉染后IL-1β誘導處理過的軟骨細胞相對存活情況是（0.89±0.19），miR-543 mimics轉染后軟骨細胞的增殖率明顯高于對照組（P=0.024），經過IL-1β誘導處理的軟骨細胞增殖能力顯著低于對照組（P=0.027），經過miR-543 mimics轉染后IL-1β誘導處理過的軟骨細胞增殖能力顯著上升（P=0.035），miR-543 mimics轉染能夠逆轉IL-1β對細胞增殖作用的抑制效果，見圖2。

2.3 miR-543表達水平上調對骨關節炎軟骨細胞凋亡相關基因表達的影響分析

研究發現，對照組的MDM4、Akt1和Bcl-2相對表達水平均是1.00，經過IL-1β誘導處理組的MDM4、Akt1和Bcl-2相對表達水平分別是（1.47±0.29）、（0.64±0.18）和（0.49±0.12），miR-543 mimics轉染組的MDM4、Akt1和Bcl-2相對表達水平分別是（0.46±0.17）、（1.42±0.24）和（1.51±0.18），經過miR-543 mimics轉染后IL-1β誘導處理組的MDM4、Akt1和Bcl-2相對表達水平分別是（0.97±0.12）、（0.87±0.19）和（0.82±0.11）。miR-543 mimics轉染細胞MDM4 mRNA表達水平明顯低于對照組（P=0.028），Akt1和Bcl-2 mRNA的表達顯著高于對照組（P=0.024，0.260），經過IL-1β誘導處理后的軟骨細胞MDM4 mRNA表達顯著高于對照組（P=0.030），Akt1和Bcl-2 mRNA表達則顯著低于對照組（P=0.028、0.027），經過miR-543 mimics轉染后，IL-1β誘導處理過的軟骨細胞MDM4、Akt1和Bcl-2 mRNA表達水平的變化能夠得到顯著緩解（P=0.022、0.024、0.027），見圖3。

3 討論

此次研究中，通過大鼠OA模型的構建進行研究，研究結果表明，研究組大鼠的軟骨組織中miR-543的表達水平顯著低于對照組（P<0.05），經過IL-1β誘導處理的軟骨細胞miR-543的表達水平顯著低于未進行誘導處理的軟骨細胞（P<0.05）;miR-543 mimics轉染后軟骨細胞的增殖率明顯高于對照組，經過IL-1β誘導處理的軟骨細胞增殖能力顯著低于對照組（P<0.05），經過miR-543 mimics轉染后IL-1β誘導處理過的軟骨細胞增殖能力顯著上升（P<0.05），miR-543 mimics轉染能夠逆轉IL-1β對細胞增殖作用的抑制效果;miR-543 mimics轉染細胞MDM4 mRNA表達水平明顯低于對照組，Akt1和Bcl-2 mRNA的表達顯著高于對照組（P<0.05），經過IL-1β誘導處理后的軟骨細胞MDM4 mRNA表達顯著高于對照組，Akt1和Bcl-2 mRNA表達則顯著低于對照組（P<0.05），經過miR-543 mimics轉染后，IL-1β誘導處理過的軟骨細胞MDM4、Akt1和Bcl-2 mRNA表達水平的變化能夠得到顯著緩解（P<0.05）。研究結果表明，miR-543表達可能屬于骨關節炎分子生物學的病因，通過miR-543表達水平的監測，能夠為骨關節炎疾病的發生發展情況提供依據，同時外源性的miR-543補充能夠在骨關節炎病情控制中發揮積極作用。

骨關節炎疾病發展過程中，軟骨細胞異常凋亡屬于主要作用機制之一，MDM4能夠定位在凋亡的關鍵細胞器線粒體上，將TP53線粒體的凋亡途徑激活，同時還能夠抑制抗凋亡蛋白Bcl-2，增加細胞色素C釋放，進而產生促進細胞凋亡的效果;至于Akt1能夠對mTOR信號通路進行調控，從而減緩細胞凋亡。miR-543表達水平上調后，MDM4表達下降，而Akt1、Bcl-2表達上升，在IL-1β誘導作用后，miR-543表達能夠使MDM4釋放受到抑制，提升Akt1、Bcl-2表達水平[12-13]。在骨關節炎發病當中，炎癥因子的過表達和病情嚴重程度具有密切關系，大量釋放炎癥因子既會導致軟骨細胞損傷，還會使軟骨細胞分化及誘導ECM降解的作用受到影響[14-15]。

綜上所述，OA大鼠的軟骨組織miR-543表達會顯著下降，通過miR-543 mimics轉染促進miR-543表達上調，能夠使軟骨細胞的增殖得到提升，加之對MDM4、Akt1、Bcl-2表達的影響，能夠有效對抗IL-1β誘導引發的軟骨細胞損傷。

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（收稿日期：2019-07-10） （本文編輯：張亮亮）