復方鱉甲軟肝片對肝纖維化大鼠的保護作用及其機制*

孫振亮，吳 哲，貴襄平，田凌云，李先鵬

（1. 湖北省保康縣人民醫院感染科，湖北 保康441600；2. 湖北中醫藥大學附屬襄陽醫院肝膽病科，湖北 襄陽441000；3.寧波市鄞州人民醫院肝病科，浙江 寧波315040）

肝纖維化既是慢性肝病的結果，同時也是肝硬化發病的必經階段，因此，對于肝纖維化的防治，可有效延緩慢性肝病的進展并改善患者臨床預后[1-2]。復方鱉甲軟肝片是臨床上肝纖維化防治的復方制劑，對于早期肝硬化具有明顯的阻斷作用[3-4]。目前相關動物研究證實，復方鱉甲軟肝片可顯著改善CCL4肝纖維化大鼠肝組織炎癥程度以及大鼠的肝纖維化程度，但是對于其具體的作用機制，目前尚無統一認識[5]。為進一步了解復方鱉甲軟肝片對肝纖維化大鼠作用機制，本研究探討復方鱉甲軟肝片對肝纖維化大鼠的保護作用及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇清潔級SD 雄性大鼠30 只，體質量（250±10）g，購于重慶國家生物產業基地實驗動物中心，實驗動物使用許可證SYXK（渝）2017-0023。

1.2 主要試劑及儀器 復方鱉軟肝片，購于內蒙古福瑞醫療科技股份有限公司，國藥準字Z19991011；IV 型膠原（CIV）、透明質酸（HA）以及層粘連蛋白（LN）ELISA 試劑盒均購于北京北方生物技術研究所；CCL4 購于上海凌峰化學試劑有限公司；丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、總膽紅素（TBil）、白蛋白（ALB）、總蛋白（TP）試劑盒購于深圳邁瑞生物醫療股份有限公司；兔抗COX-2 多克隆抗體購于美國Noemarkers 公司；鼠抗α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）單克隆抗體購于武漢博士德生物技術有限公司。BSA124S 電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；臺式高速冷凍離心機（Heal Force 公司）；全自動生化分析儀（深圳雷杜生命科技有限公司）；酶標儀（美國Bio Tek 儀器有限公司）；倒置熒光顯微鏡（奧林巴斯（中國）有限公司）。

1.3 方法 將30 只大鼠隨機分為3 組，分別是對照組、模型組、藥物組，每組各10 只。其中模型組、藥物組使用橄欖油配制40% CCL4，進行皮下注射造模，注射劑量3 mL/kg，每周2 次，首次注射劑量加倍，連續注射6 周；對照組大鼠使用等容量橄欖油皮下注射。造模同時，藥物組大鼠給予1 g/kg·d-1復方鱉甲片灌胃（磨成粉末后用生理鹽水配制），而對照組、模型組每天給予等容量生理鹽水灌胃，灌胃均為6 周。各組大鼠均自由飲水，使用標準飼料飼養。

末次給藥后，禁食不禁水12 h，抽取大鼠腹主動脈血，離心5 min（3 000 r/min），分離血清置于-80 ℃冰箱內保存待測，使用全自動生化分析儀檢測大量肝功 能 指 標ALT、AST、T-Bil、ALB、TP 水 平；采 用ELISA 法檢測大鼠纖維化指標HA、CIV、LN 水平。

取各組大鼠部分肝組織，使用4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，采用免疫組化法檢測大鼠COX-2、α-SMA 蛋白表達情況。評價標準：COX-2蛋白陽性染色主要表現為細胞膜和/或細胞漿呈棕黃色著色；α-SMA 蛋白陽性表達主要表現為細胞漿呈棕黃色表達。根據蛋白表達程度以及著色陽性細胞范圍評分。陽性程度：0 分：不著色；1 分：著色淡；2 分：中等著色；3 分：著色深。陽性細胞范圍：0 分：無著色；1 分：著色陽性細胞數＜30%；2分：著色陽性細胞數在30%～50%之間；3 分：著色陽性細胞數>50%。蛋白表達積分為著色程度以及陽性細胞數得分之和。

1.4 統計學分析 采用統計學分析SPSS 22.0 進行數據處理分析，計量資料比較采用t 檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肝功能指標比較 模型組、藥物組ALT、AST、T-Bil 水平較對照組顯著升高（P＜0.05），但藥物組ALT、AST、T-Bil 水平明顯低于模型組（P＜0.05）；而模型組、藥物組ALB 較對照組顯著降低（P＜0.05），但藥物組ALB 水平明顯高于模型組（P＜0.05）；3 組TP 水平無顯著差異（P>0.05），見表1。

表1 各組大鼠肝功能指標比較（

表1 各組大鼠肝功能指標比較（

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

2.2 各組大鼠纖維化指標比較 模型組、藥物組HA、CIV、LN 水平較對照組顯著升高（P＜0.05），藥物組HA、CIV、LN 水平明顯低于模型組（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠纖維化指標比較（s，U/L）

表2 各組大鼠纖維化指標比較（s，U/L）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

2.3 各組大鼠COX-2、α-SMA 蛋白表達情況比較模型組、藥物組COX-2、α-SMA 蛋白表達較對照組顯著升高（P＜0.05），藥物組COX-2、α-SMA 蛋白表達明顯低于模型組（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠COX-2、α-SMA 蛋白表達情況比較（，分）

表3 各組大鼠COX-2、α-SMA 蛋白表達情況比較（，分）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

3 討論

肝纖維化是一切慢性肝病，如血吸蟲病、酒精性肝病、病毒性肝炎的共同病理基礎，是慢性肝病發展至肝硬化的必經過程，同時與肝癌的發生也具有著一定的關系[6-7]。對于肝病的肝纖維化階段，若采取恰當的治療方案，可有效逆轉肝纖維化進程，并促進肝病的恢復，因此，采取有效的抗纖維化藥物對于控制肝病的發展具有臨床意義[8]。根據慢性肝病的病因病機及患者臨床表現，可將肝纖維化歸屬于中醫學“積聚”“癥瘕”“脅痛”等范疇。肝纖維化因濕、熱、痰、瘀、毒、郁等作用，導致機體正氣不足，邪毒留滯于肝，從而導致脈絡瘀阻、氣機郁滯，因此臨床治療應以疏肝活血、軟堅散結為治療原則[9]。復方鱉甲軟肝片有黨參、三七、鱉甲、當歸、板藍根等藥物組成，具有化瘀解毒、軟堅散結、益氣養血之功效[10-11]。本研究采用CCL4誘導肝纖維化，同時使用復方鱉甲軟肝片進行干預治療，分析復方鱉甲軟肝平對肝纖維化大鼠的保護作用及其機制。

研究顯示[12-13]，采用CCL4誘導大鼠肝纖維化模型，CCL4誘導產生過量的自由基可引發肝細胞膜脂質過氧化，誘導釋放大量炎性因子使干細胞的損傷，肝細胞內轉氨酶ALT、AST 水平顯著升高，引起蛋白質合成代謝功能降低。模型組、藥物組大鼠ALT、AST、T-Bil 水平較對照組顯著升高（P＜0.05），藥物組大鼠ALT、AST、T-Bil 水平 明 顯 低于 模 型組（P ＜0.05）；而模型組、藥物組大鼠ALB 較對照組顯著降低（P＜0.05），但藥物組大鼠ALB 水平明顯高于模型組（P＜0.05）。與相關研究結果相似[14]，采用CCL4誘導大鼠肝纖維化模型，可造成大鼠肝功能損傷以及白蛋白水平的降低，而采取復方鱉甲軟肝片干預后，可有效降低大鼠肝功能損傷，從而對肝纖維化大鼠具有著良好的肝功能保護作用。目前臨床上常用的肝纖維化血清標志物主要由HA、CIV 以及LN，研究顯示，HA、CIV、LN 水平與肝纖維化程度呈顯著正相關關系。本研究結果顯示，模型組、藥物組大鼠HA、CIV、LN 水平較對照組顯著升高（P＜0.05），但藥物組大鼠HA、CIV、LN 水平明顯低于模型組（P＜0.05）。提示CCL4可有效誘導大鼠肝纖維化的發生，而采取復方鱉甲軟肝片干預，可有效阻止肝纖維化進程，減輕大鼠肝纖維化病情。

COX-2 是前列腺素合成酶亞型，主要在炎癥因子以及細胞因子刺激下表達，可促進前列腺素合成，引起微血管障礙而引起血管內皮損傷，啟動機體炎癥級聯反應，參與機體多種組織以及細胞炎癥反應當中[15]。研究顯示[16]，在CCL4誘導慢性肝損傷大鼠肝纖維化進程中，可表現出COX-2 蛋白表達的顯著增加，且隨著肝纖維化嚴重程度的加劇而增加。此外，α-SMA 蛋白的表達與肝星狀細胞（HSC）活化有關，參與到了肝纖維化的發生發展過程當中[17-18]。研究分析復方鱉甲軟肝片干預對肝纖維化大鼠COX-2、α-SMA 蛋白表達的影響，結果顯示，模型組、藥物組COX-2、α-SMA 蛋白表達較對照組顯著升高（P＜0.05），藥物組COX-2、α-SMA 蛋白表達明顯低于模型組（P＜0.05）。提示復方鱉甲軟肝片干預對肝纖維化大鼠肝功能保護作用、延緩肝纖維化疾病進程，其可能機制與抑制肝組織COX-2、α-SMA 蛋白表達有關。