復方參鹿顆粒調節相對低危骨髓增生異常綜合征患者TGF-β1 介導的Treg/Th17 細胞變化的臨床研究*

陸穎佳，陳 珮，邱仲川，趙 琳，胡曉瑩，朱小勤，瞿瑋穎，封 舟，黃中迪

（上海中醫藥大學附屬曙光醫院血液科，上海200021）

骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes，MDS）是起源于造血干細胞的一組異質性髓系克隆性疾病，特點是髓系細胞發育異常，表現為無效造血、難治性血細胞減少，高風險向急性髓系白血病轉化[1]。相對低危MDS 是其中向白血病轉化的概率相對較低的部分患者，預后相對較好，主要表現為無效造血、難治性血細胞減少，目前此類患者無針對性治療，以支持治療、免疫調節、免疫抑制為主。研究發現Th17 細胞（T helper cell 17，Th17）的增高、Treg 細胞（T regulatory cells，Treg）的降低，及其比率的異常導致低危MDS 患者的自身免疫異常，導致血細胞降低[2-4]。TGF-β 是一種轉化生長因子（transforming growth factor-β，TGF-β），對Th17 細胞、Treg 細胞有調控作用。TGF-β1 是TGF-β 家族中的一個亞型，其與免疫系統相關，與Treg 細胞擴增有關，也是研究造血系統TGF-β 的主要對象。研究顯示IL-6 和TGFβ1 可以活化Th17 細胞[5]，IL-2 和TGF-β1 可增強維持Treg 細胞[6]。我院自制制劑復方參鹿顆粒可以提高MDS 患者紅細胞數量及血紅蛋白含量，并可提高患者的CD4+、CD4+/CD8+比值、NK 數值，使CD8+數值下降[7]。為進一步了解復方參鹿顆粒對相對低危MDS 患者細胞免疫的影響，本研究檢測復方參鹿顆粒治療相對低危MDS 患者治療前后TGF-β1、IL-2、IL-6、Treg細胞、Th17 細胞、Foxp3mRNA、RORγtmRNA 水平及相關比值，現報告如下。

1 資料和方法

1.1 研究對象 選取均來自上海中醫藥大學附屬曙光醫院血液科于2016 年5 月－2018 年6 月間住院收治者的骨髓增生異常綜合征屬相對低危患者40 例，其中男性18 例，女性22 例，中位數年齡43 歲（19～75歲）。隨機分為2 組，中藥組20 例，對照組20 例。中藥組中男性10 例，女性10 例，中位數年齡45 歲（19～75歲）；對照組男性8 例，女性12 例，中位數年齡42 歲（23～68 歲），初發血象2 組患者性別、年齡均無明顯差異（P>0.05），具有可比性。

1.2 納入及排除標準 納入標準：所有病例診斷均符合國內MDS 診斷標準[1]，并按照IPSS 積分標準分期，符合相對低危MDS（包括IPSS 評分的低危、中危-1），無嚴重心肺疾病及肝腎功能損害而能配合口服中藥制劑者皆為納入病例。中醫辨證標準：中醫腎陽虛證標準參照《中藥新藥臨床研究指導原則》[8]中腎陽虛證的診斷標準制定。排除標準：①繼發性MDS及MDS 合并有其它血液病或惡性腫瘤者；②有嚴重心肺疾病及肝腎功能損害者；③未按規定用藥、無法判定療效者。

1.3 治療方法 對照組服用環孢霉素A（杭州中美華東制藥有限公司，批號120932），3～6 mg/（kg·d），分早晚2 次口服，血藥濃度維持在100～300 ng/L。中藥組同時加用予復方參鹿顆粒（藥用紅參須、熟附子、肉桂、鹿角片、炙龜板、菟絲子等，本院院內制劑，滬藥制Z06100005，參照《中華人民共和國藥典》2000 版的要求制成沖劑，每包12 g，批號20120302），劑量：成人每次服用1 包，3 次/d，2 組治療均以6 個月為1個療程，共1 個療程。必要時予輸血支持治療；感染者予抗感染治療。本試驗經過我院倫理委員會批準，并取得所有研究對象的知情同意。

1.4 檢測方法

1.4.1 外周血Treg 細胞檢測 分別于治療前后采集外周血，應用熒光免疫直接標記法及FCM 檢測外周血CD4+CD25+CD127lowTreg 細胞。加入CD4-FITC、CD25-PE、CD127-PE 各20 μL，振蕩混勻，室溫避光孵育20 min 后，每管各加入250 μL 的Cytofix/Cytoperm 液，室溫避光20 min，380×g 離心5 min，棄上清液，加入PBS 液1 mL，1 500 r/min 離心10 min，棄上清液，加入PBS 液1 mL 混勻后，應用FAC-Station流式細胞儀對每管標本采集個細胞進行分析，使用美國BD 公司的Celquest 軟件，以CD4+細胞設門來分析CD4+CD25+CD127lowTreg 細胞所占的百分比。

1.4.2 外周血Th17 細胞檢測 分別于治療前后采集外周血，調節細胞濃度為2×106細胞/mL。加入CD3-PerCP、CD4-PE-cy7 各20μL，混勻，室溫避光孵育15～20 min。加入Cytofix/Cytoperm 液250 μL，室溫放置20 min。加入Perm/Wash 液1 mL，1 500 r/min離心5 min，棄上清，清洗2 次，用50 μL Perm/Wash液重懸A、B 管。實驗管A 中加入BD IL-17A-PE 20 μL，避光孵育30 min。加入Perm/Wash 液1 mL 洗滌2 次。最后以300 μL Staining Buffer 染色緩沖液重懸細胞。采用Cellquest 軟件獲取分析細胞。以前向角（FSC）和側向角（SSC）散射光散點圖設門區分淋巴細胞，以CD3 和CD4 散點圖設門區分Th 細胞（CD3+CD8-）。以IL-17A 的曲線圖表示Th17 細胞，計算IL-17A+Th17 細胞在CD3+CD8-T 細胞中的比率。

1.4.3 外周血Foxp3 mRNA、RORγt mRNA 檢測 提取TotalRNA 后，逆轉錄后，進行熒光定量PCR，反應條件：95 ℃30 sec 1 個循環、95 ℃5 sec，60 ℃34 sec 持續共40 個循環→95 ℃15 sec，60 ℃1 min，95℃15 sec。最后讀取目的基因與內參基因CT 值，計算2-△CT 值統計。各基因引物序列如下：

RORγt F：5'-CTGCAAGACTCATCGCCAAAG-3'；

RORγt R：5'-TTTCCACATGCTGGCTACACA-3'；

Foxp3 F：5'GGGTAGCCATGGAAACAGCA-3'；

Foxp3 R：5'TCGCATGTTGTGGAACTTGAAGTAG-3'；

β-actin F：5'AAGGTGACAGCAGTCGGTT-3'；

β-actin R：5'TGTGTGGACTTGGGAGAGG-3'；

1.4.4 外周血TGF-β1、IL-2、IL-6 檢測 TGF-β1、IL-2、IL-6 均用ELISA 雙抗體夾心法檢測，具體操作按照試劑盒提供的說明書進行。

1.5 統計方法 采用SPSS17.0 統計軟件對數據進行統計學分析，符合正態分布和方差齊性的計量資料采用均數±標準差（s）表示，不符合正態分布的計量資料采用中位數表示。計量資料采用t 檢驗；不符合正態分布的計量資料和計數資料采用秩和檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血Treg 細胞表達、Th17 細胞表達，Treg/Th17 比值比較 中藥組治療前后Treg 細胞表達、Treg/Th17 比值低均有明顯差異（P＜0.05），對照組治療前后無明顯差異（P>0.05）。治療前中藥組與對照組的Th17 表達、Treg 表達，Treg/Th17 比值均無明顯差異（P>0.05）；治療后中藥組Th17 細胞無明顯差異（P>0.05），Treg 細胞表達與Treg/Th17 比值均高于對照組，組間比較有明顯差異（P＜0.05）。見表1。

表1 2 組治療前后Treg 細胞表達、Th17 細胞表達變化，Treg/Th17 比值變化比較

2.2 外 周 血 RORγt、Foxp3mRNA 表 達、Foxp3/RoRγt mRNA 比值比較 中藥組治療后RORγt mRNA 表達上升，無明顯差異（P>0.05）、Foxp3mRNA 表達、Foxp3/RoRγt 比值檢測均有所提升，較治療前有明顯差異（P＜0.05）；對照組治療后RORγt mRNA 表 達、Foxp3mRNA 表 達、Foxp3/RoRγt 比 值檢測較治療前有所上升，無明顯差異（P>0.05）。治療前中藥組與對照組的Foxp3mRNA、RORγt mRNA 表達、Foxp3/RoRγt 比值無明顯差異（P>0.05）；但治療后中藥組Foxp3mRNA 表達、Foxp3/RoRγt比值檢測均高于對照組，組間比較有差異（P ＜0.05）。見表2。

表2 治療前后RORγt、Foxp3mRNA 表達、Foxp3/RoRγT 比值變化

2.3 外周血TGF-β1、IL-2、IL-6 及IL-2/IL-6 比值檢測結果比較 組內治療前后比較：中藥組治療后IL-2 表達上升，無明顯差異（P>0.05）；IL-6 表達下降，較治療前有明顯差異（P＜0.05）；TGF-β1、IL-2/IL-6 比值上升，較治療前有明顯差異（P＜0.05）。對照組治療后TGF-β1、IL-2 表達與治療前比較有所上升，但無明顯差異（P>0.05），IL-6 比值檢測較治療前有所下降，無明顯差異（P>0.05）；IL-2/IL-6 比值上升，較治療前有明顯差異（P＜0.05）。中藥組與對照組的組間比較：中藥組與對照組的治療前均無明顯差異（P>0.05）；但治療后中藥組TGF-β1、IL-2/IL-6 比值均高于對照組，組間比較有明顯差異（P＜0.05）；IL-6 表達低于對照組，組間比較有明顯差異（P＜0.05）。見表3。

表3 2 組治療前后TGF-β1、IL-2、IL-6 及IL-2/IL-6 比值檢測結果比較

3 討論

相對低危MDS 患者主要以無效造血、難治性血細胞減少為主要表現，雖然向白血病轉化的概率相對較低，然而研究顯示相對低危MDS 預后較差的因素有血小板減少、需要輸血的貧血、老年、較高的骨髓原始細胞、和預后差的染色體核型[9]，貧血是患者的生存質量相關的主要因素，輸血依賴的患者醫療費用也增加[10-11]。改善造血、提高生活質量是相對低危MDS患者的首要目標。

復方參鹿顆粒是有我院血液科創始人吳翰香老先生在多年的臨床實踐總結得出的經驗制劑。吳老認為治療應根據MDS 病情程度，發病具有異質性的特點，采取辨證辨病相結合進行治療，MDS 發病機制是“精髓虧乏，氣血雙虧是為本，邪毒內蘊相兼，正邪消長為軸”[12]，而相對低危MDS 患者在正邪消長中以精髓虧乏、氣血雙虧為主。從中醫理論分析，腎主骨生髓，腎精不足則髓不生血，故吳老先生將以溫腎益髓為治療大法的復方參鹿顆粒用于相對低危MDS，方中重用紅參須、鹿角片、附子、肉桂、菟絲子、肉蓯蓉、補骨脂溫陽益氣；熟地黃、龜甲、枸杞子滋補腎陰；陰陽雙補，以填精生髓。既往臨床研究總結表明，復方參鹿顆粒具有提高相對低危MDS 患者紅細胞數量、血紅蛋白含量，其總有效率為85%，優于對照組；同時，發現其有改善T 細胞免疫功能的作用，可提高患者的CD4＋，CD4＋/CD8＋比值，NK 數值，使CD8＋數值下降，并與其改善患者貧血程度相關[7]。

研究表明[13]在MDS 早期階段，免疫紊亂和自身免疫可能導致無效造血系統和骨髓造血失敗。Th17細胞可以觸發免疫紊亂的應答。循環Th17 細胞的擴增占主導地位，支持炎癥自身免疫最終導致骨髓的細胞凋亡[3]，IL-17 和IL-17 受體的mRNA 在低危MDS患者較高危和正常組增高，增高的IL-17 與嚴重貧血有關[14]。低危MDS 患者的Treg 細胞的分布更低，因此導致針對發育不良的克隆的自身免疫反應。低危患者Treg 細胞水平低，更多地表現為異常紅系造血[15]。Treg 細胞的數量在輸血依賴的病人中比無輸血依賴的人更低[2]。低危患者更高Th17/Treg 率是與細胞凋亡率正相關[4]。CD8+細胞毒性T 細胞和數量減少的Treg 細胞在低危MDS 患者中是互相關聯的[15]。

研究顯示，低危MDS 患者的MSC 相比正常的MSC 分泌更多的IL-6，更少的TGF-β1[16]。IL-2 是Treg 細胞的一個決定性的細胞因子，與TGF-β 聯合在推動Treg 細胞的功能和穩態[6]。MDS 中IL-2 活性降低，提示免疫力低，與病情預后相關[17]。

此次研究顯示，治療后中藥組TGF-β1、IL-2/IL-6 比值、Treg 細胞表達、Treg/Th17 比值、及Foxp3mRNA 表達、Foxp3/RoRγt 均較對照組有所提高，IL-6 表達較對照組下降，且與治療前有明顯差異，提示復方參鹿顆粒對TGF-β1、IL-2/IL-6、Treg 細胞表達、Treg/Th17 比值及其功能蛋白Foxp3mRNA 表達、Foxp3/RoRγt 比值有一定調控作用，并可能通過調控兩者平衡來改善血象。

有文獻報道，Treg 細胞絕對數的升高與貧血、血紅蛋白降低、原始細胞升高相關，向高危發展[18]，高比例的Treg 細胞與生存較差的相對低危MDS 患者相關[19]，早期MDS 患者出現CD4+CD25high+CD127lowTreg細胞增高[20]，作為保護性機制導致的免疫過亢引起的細胞過度凋亡與自我免疫抑制引起的腫瘤逃逸這一矛盾，尚無有效的解決方案，然而在臨床治療中免疫抑制治療有一定的療效。

有研究認為，TGF-β1 是一個骨髓抑制的細胞因子，TGF-β1 血漿水平在MDS 患者中增高，與其造血抑制有關[21]，TGF-β1 與IL-6 促進Th17 細胞分化[5]，IL-6 減少Foxp3[22]，MDS 患者中IL-6 亦增加[23]，TGFβ1 的抑制造血作用是否與IL-6 增加，導致Treg 細胞降低有關。而我們在復方參鹿顆粒治療隨訪中并未出現與其治療相關的血象惡化或向高危發展的傾向，而TGF-β1 在體內抑制骨髓和促進Treg 細胞分化啟動的有效濃度折點是多少，其與MDS 惡性克隆基因是否存在相關性均有待進一步研究。